Sơ đồ tổng hợp hệ xúc tác Ge-His-He

Bảng 2.3. Khối lượng He tương ứng với các tỉ lệ phản ứng giữa (Ge–His)–He

(w/w)

Tỉ lệ phản ứng giữa (Ge–His)–He (w/w)

Khối lượng He tham gia phản ứng (mg)

Thể tích NaOH để hoà tan He (mL) 1 : 0,25 25 25 1 : 0,50 50 50 1 : 0,75 75 75 1 : 1,00 100 100 100 mg Ge–His trong 10 mL NaOH Hoà tan He theo

các tỉ lệ 1:0,25; 1:0,5; 1:0,75; 1:1 Hệ xúc tác Ge-His-He Thẩm tách sản phẩm trong 3 ngày

Đông khô thu sản phẩm

Hòa tan hoàn toàn 100 mg Ge–His trong 10 mL dung dịch NaOH 0,1 N. Hoà tan He theo các tỷ lệ phản ứng bằng dung dịch NaOH 0,1 N (Bảng 2.1). Nhỏ từ từ dung dịch He vào dung dịch Ge–His. Phản ứng được thực hiện trong môi trường kỵ sáng trong 24 h. Tiến hành thẩm tách dung dịch bằng màng thẩm tách 12–14 kD trong ba ngày để loại bỏ hoàn toàn lượng He chưa phản ứng. Dung dịch sau thẩm tách dược đông khô để thu sản phẩm. Sản phẩm được xác định cấu trúc hoá học bằng FT–IR, Raman, đánh giá hoạt lực và hoạt tính bằng UV–Vis, đánh giá khả năng tạo hydrogel.

2.2.3. Hoạt hoá Hemin trong môi trường kiềm (Hemin–NaOH)

Hòa tan hoàn toàn 100 mg He trong 100 mL dung dịch NaOH 0,1 N. Phản ứng được thực hiện trong môi trường kỵ sáng trong 24 h. Tiến hành thẩm tách dung dịch bằng màng thẩm tách Spectra/Por, MWCO 12–14 kD trong 3 ngày để loại bỏ hoàn toàn lượng NaOH chưa phản ứng. Dung dịch sau thẩm tách dược đông khô để thu sản phẩm. Sản phẩm được đánh giá hoạt lực bằng UV–Vis và đánh giá khả năng tạo hydrogel so với hệ xúc tá Ge–His–He

2.2.4. Hiệu suất tổng hợp Gelatin–Histamine–Hemin

Tiến hành quét bước sóng hấp thụ của He ở các nồng độ khác nhau. He được hòa tan trong dung dịch đệm PBS pH 10 với các nồng độ lần lượt là 5 ppm, 8 ppm, 10 ppm, 12 ppm, 15 ppm, 18 ppm và 20 ppm. Mẫu sau khi đồng nhất được cho vào cuvette thạch anh và tiến hành đo độ hấp thụ của He để xác định bước sóng mà tại đó He có độ hấp thụ thay đổi nhiều nhất – gọi bước sóng đó là Amax. Thực hiện đồng

thời với Ge–His và hệ xúc tác Ge–His–He. Sau khi xác định được bước sóng mà tại đó He có độ hấp thụ thay đổi nhiều nhất, tiến hành dựng đường chuẩn của He trong môi trường đệm PBS pH 10. He được hòa tan trong dung dịch đệm PBS pH 10 với các nồng độ lần lượt là 0 ppm (baseline), 1 ppm, 2 ppm, 3 ppm, 4 ppm, 5 ppm và 8 ppm. Mẫu sau khi đồng nhất được cho vào cuvete thạch anh và tiến hành dựng đường chuẩn của He ở bước sóng Amax. Đồ thị biểu diễn tỉ lệ nồng độ He và độ hấp thụ

(đường chuẩn) sẽ cho kết quả là phương trình đường thẳng dạng y = ax + b. Trong đó:

y: là độ hấp thụ của He ở bước sóng có độ hấp thụ thay đổi nhiều nhất. x: là nồng độ He trong đệm PBS pH 10

Có được đường chuẩn, bước cuối cùng là tiến hành đo hiệu suất và hiệu quả gắn He cùa các hệ xúc tác đã tổng hợp. Chuẩn bị dung dịch hệ xúc tác đã tổng hợp (cả 4 tỷ lệ) nồng độ 25 ppm trong dung dịch đệm PBS pH 10. Mẫu sau khi đồng nhất được

cho vào cuvette thạch anh và tiến hành đo độ hấp thụ của các hệ xúc tác ở bước sóng

Amax. Lập bảng tính toán nồng độ He lý thuyết như Bảng 2.2:

Bảng 2.4. Các thông số tính toán hiệu suất phản ứng và hiệu quả mang He

Tỷ lệ Nồng độ xúc tác (ppm) Chất nền Ge–His (mg) He (mg) Tổng (mg) Nồng độ He lý thuyết (ppm) 1 : 0,25 25 100 25 125 5,000 1 : 0,50 100 50 150 8,333 1 : 0,75 100 75 175 10,714 1 : 1,00 100 100 200 12,500

Trong đó, nồng độ He tính theo lý thuyết được tính bằng hàm lượng He so với hàm lượng tổng trong dung dịch xúc tác (dung dịch Ge–His–He) tại 25 ppm được mô tả bởi biểu thức như sau:

[He]lý thuyết = (mHe / mtởng) × 25 (ppm)

Các giá trị khi tiến hành đo hiệu suất phản ứng và hiệu suất mang He được ghi nhận, lập phương trình tính toán, từ đó biện luận để tìm được hệ xúc tác tối ưu. (Dữ liệu cho các kết quả được biểu diễn bằng trung bình của ba lần đo). H (%) biểu thị cho hiệu suất tổng hợp hệ xúc tác Gel–His–He (lượng He tham gia phản ứng tạo phức với hệ Ge-His). C (%) biểu thị cho hiệu suất mang He (hàm lượng He trong cả hệ xúc tác Ge-His-He). Trong đó, giá trị H (%) được tính bằng tỷ số giữa nồng độ He thực tế và nồng độ mẫu đo, còn giá trị C (%) được tính bằng tỷ số giữa nồng độ He thực tế và nồng độ He theo lý thuyết, được mô tả lần lượt ở các biểu thức dưới đây,

C = [(nồng độ He thực tế đo được) / (nờng độ xúc tác)] × 100%

H = [(nờng độ He thực tế đo được) / (nờng độ He theo lý thút] × 100%

2.3. Đánh giá hoạt lực của Gelatin–Histamine–Hemin trên Guaiacol

TTGA – sản phẩm của q trình oxy hóa GA – được định lượng bằng phương pháp UV–Vis dựa trên sự thay đổi giá trị độ hấp thụ ở bước sóng 470 nm. Chuẩn bị các dung dịch sau đây: dung dịch hệ xúc tác nồng độ 80 ppm (ở bốn tỷ lệ đã tổng hợp); H2O2 nồng độ 21,35 %; GA nồng độ 10 mM và đệm phosphate pH 5 nồng độ

100 mM. Hàm lượng của các dung dịch được cho vào cuvette thạch anh ở Bảng 2.3. Lưu ý, tổng thể tích của hỗn hợp là 3,5 mL và H2O2 được thêm vào cuối cùng (khi bắt đầu phản ứng). Hỗn hợp được đồng nhất và tiến hành đo độ hấp thụ sau các khoảng thời gian 20 s, 60 s, 120 s và 180 s (thời điểm thêm H2O2 để bắt đầu phản ứng được quy cho 0 s). Phạm vi quang phổ quan sát từ 300 đến 600 nm. Sự gia tăng độ hấp thụ ở bước sóng 470 nm được ghi nhận lại sau khi thêm H2O2. Ghi nhận các giá trị đo và tiến hành tính toán tìm giá trị Vmax, Km. Tính giá trị Vm/Km để tìm ra mẫu có hoạt lực tối ưu nhất. Tiến hành thực hiện trên bốn tỷ lệ của hệ xúc tác đã tổng hợp và thực hiện đồng thời với enzyme HRP và He–Na

Bảng 2.5. Hàm lượng của các dung dịch trong hỗn hợp được cho vào cuvette trong

phép đo hoạt lực enzyme

STT Thể tích Gu (mL) Thể tích đệm (mL) Thể tích xúc tác (mL) Thể tích H2O2 (mL) Tổng (mL) 1 0,5 2,8 0,1 0,1 3,5 2 0,4 2,9 3 0,3 3 4 0,2 3,1 5 0,1 3,2 6 0,05 3,25

2.4. Đánh giá hoạt tính xúc tác của hệ xúc tác Gelatin–Histamine–Hemin trên Pyrogallol

Sau khi tiến hành phép đo hoạt lực của bốn hệ xúc tác, HRP và He–Na, tính toán được các giá trị Km và Vmax, tiến hành quy đổi để HRP (10 ppm) và hệ xúc tác Ge–His–He có cùng giá trị hoạt lực (cùng lượng tâm xúc tác) như sau:

Cb (ppm) = [( Vmax (HRP)

Km(HRP) ) ∶ ( Vmax (Ge−His−He)

Km(Ge−His−He) )] x 80 (ppm)

Trong đó:

Cb : Nồng độ xúc tác quy đổi để hệ xúc tác có cùng hoạt lực với HRP (10 ppm) 80 ppm: là nồng độ hệ xúc tác trong phép đo hoạt lực

Bảng 2.6. Hàm lượng của các dung dịch được cho vào cuvette trong phép đo hoạt tính STT Thể tích PLG (𝛍𝐋) Thể tích hệ xúc tác

(𝛍𝐋)

Nồng độ H2O2 (mM)

Thể tích H2O2 ứng với các nồng

độ (𝛍𝐋) Thể tích nước (𝛍𝐋) Tổng (𝛍𝐋) 1 1225 87,5 2 23,8 2163,7 3500 2 5 59,5 2128,0 3 10 119 2068,5 4 30 357 1830,5 5 50 595 1592,5 6 70 833 1354,5 7 100 1190 997,50

Chuẩn bị các dung dịch sau đây: Dung dịch hệ xúc tác nồng độ Cb (ppm) đã quy đổi ở trên (tỷ lệ có hoạt lực cao nhất); dung dịch HRP 10 ppm; dung dịch H2O2 ở các nồng độ lần lượt 2, 5, 10, 30, 50, 70, 100 mM; PLG 0,2 % và nước khử ion đã loại bỏ khí. Tiến hành chuẩn bị bảy hỗn hợp chứa các dung dịch trên theo Bảng 2.4. Sau đó cho hỗn hợp vào cuvette thạch anh. Lưu ý, tổng thể tích của hỗn hợp là 3,5 mL và H2O2 được thêm vào cuối cùng (khi bắt đầu phản ứng). Hỗn hợp được đồng nhất và được đặt trong máy quang phổ UV–Vis để đo độ hấp thụ sau các khoảng thời gian 20 s, 60 s, 120 s, 180 s, 240 s và 300 s (thời điểm thêm H2O2 để bắt đầu phản ứng được quy cho 0 s). Phạm vi quang phổ quan sát từ 300 đến 600 nm. Sự gia tăng độ hấp thụ ở bước sóng 420 nm được ghi nhận sau khi thêm H2O2. Quy trình thực hiện đối với enzyme HRP tương tự như đối với hệ xúc tác Ge–His–He.

2.5. Xác định độc tính trên nguyên bào sợi (Fibroblast) 2.5.1. Phương pháp nhuộm Sulforhodamine B

Nguyên tắc: Thử nghiệm Sulforhodamine B (SRB) là một phương pháp so màu

đơn giản và nhạy để xác định độc tính tế bào của một chất. SRB là một thuốc nhuộm tích điện âm, sẽ liên kết tĩnh điện được với các phần tích điện dương của protein. Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein tổng của tế bào. Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB. Sau đó SRB liên kết với protein

tế bào được hoà tan tạo dung dịch trong suốt có màu hồng. Mật độ quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng tế bào. Sự thay đổi tế bào so với mẫu đối chứng phản ảnh độc tính tế bào của chất nghiên cứu.

Chuẩn bị nguyên bào sợi: nguyên bào sợi (Fibroblast) được phân lập từ da quy

đầu của người. Nguyên bào sợi được nuôi cấy và bảo quản tại phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM.

Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc bằng phương pháp SRB: tế bào Fibroblast

được cấy trên những đĩa nuôi cấy 96 giếng chuyên dụng, với mật độ 104 tế bào/giếng. Sau 24 h nuôi cấy, quần thể tế bào được ủ với chất khảo sát ở nồng độ 100 μg/mL trong 48 giờ. Sau đó, protein tổng từ tế bào thử nghiệm được cố định bằng dung dịch Trichloroacetic acid (Sigma) 50% lạnh và nhuộm với dung dịch SRB 0,2% (Sigma). Các kết quả được đọc bằng máy ELISA reader ở bước sóng 492 nm và 620 nm. Các thí nghiệm được lặp lại ba lần và kết quả được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn.

Xử lý kết quả: Sau khi có giá trị mật độ quang ở bước sóng 492 nm và 620 nm (ký hiệu là OD492 và OD620):

– Tính giá trị OD = OD492 – OD620 (1)

– Tính OD492 ( hoặc OD620) = ODtb – ODblank (2) – Tính tỉ lệ % gây độc tế bào theo công thức:

%I = (1 – ODTN

ODC ) x 100% Với:

– ODtb: giá trị OD của giếng có chứa tế bào

– ODblank: giá trị OD của giếng blank (khơng có tế bào) – ODTN: giá trị OD của mẫu thử tính từ công thức (1) và (2)

– ODC: giá trị OD của mẫu chứng (control) tình từ cơng thức (1) và (2)

IC50 được xác định bằng cách sử dụng phần mềm Prism với phương pháp hồi

2.5.2. Phương pháp nhuộm Acridine Orange/Ethidium Bromide

Cấy tế bào vào đĩa 3,5 cm với mật độ 2×105 tế bào/giếng. Ni tế bào ở 37 oC, 5 % CO2 trong 24 giờ. Hút bỏ môi trường cũ, cho vào giếng môi trường mới chứa chất cảm ứng (chất thử nghiệm) ở nờng độ 100 µg/mL và dung mơi đối chứng. Sau 24 giờ và 48 giờ, tiến hành thu mẫu. Đổ bỏ dịch môi trường, rửa tế bào với PBS hai lần. Thêm vào 20 µL dung dịch thuốc nhuộm AO:EB (100 µg/mL:100 µg/mL). Đặt lame và quan sát ánh sáng huỳnh quang màu xanh và đỏ.

2.6. Đánh giá khả năng tạo hydrogel trên Ge–Tyr và khả năng thay thế enzyme HRP

Tiến hành chuẩn bị các dung dịch sau: dung dịch Ge–His–He có hoạt lực enzyme cao nhất trong số bốn mẫu tổng hợp có nồng độ Cb; dung dịch He–Na nồng độ Cb; dung dịch H2O2 nồng độ 0.2 % và dung dịch HRP 10 ppm (trong đó Cb là nồng độ xúc tác quy đổi để hệ xúc tác có cùng hoạt lực với HRP được trình bày ở phần 2.4).

2.6.1. Khảo sát thời gian gel hoá khi thay đổi hàm lượng H2O2

Bảng 2.7. Khảo sát thời gian gel hoá của hệ xúc tác tối ưu khi thay đổi hàm lượng

H2O2

STT Hệ xúc tác (Ge–His)–He Hàm lượng xúc tác (%) Hàm lượng Ge–Tyr (%) Hàm lượng H2O2 (%) Hàm lượng H2O (%) 1

Hệ xúc tác tối

ưu 0,1 15

0.01 84,89

2 0.02 84,88

3 0.03 84.87

4 0.04 84,86

Tiến hành cố định hàm lượng xúc tác Gel–His–He có hoạt lực enzyme cao nhất (0,1 %), hàm lượng chất nền Ge–Tyr (15 %) để khảo sát hàm lượng H2O2 tối ưu. Tiến hành khảo sát: cho vào eppendorf Ge–Tyr cùng hệ xúc tác Ge–His–He (hệ xúc tác có hoạt lực cao nhất) với hàm lượng lần lượt là 15 % và 0,1 %, thêm nước và đánh

votex cho hỗn hợp đồng nhất. Khi hỗn hợp đã tan hoàn toàn, tiến hành thêm lượng H2O2 cần khảo sát ở hàm lượng lần lượt là 0,01 %, 0,02 %, 0,03 %, 0,04 % và tiếp tục đánh votex đồng thời ghi nhận thời gian. Thời gian gel hoá được xác định từ khi thêm H2O2 đến khi gel bắt đầu hình thành. Hàm lượng H2O2 có thời gian gel hoá thấp nhất là hàm lượng tối ưu và được sử dụng để tiến hành các khảo sát tiếp theo

2.6.2. Khảo sát thời gian gel hoá khi thay đổi hàm lượng xúc tác

Bảng 2.8. Khảo sát thời gian gel hoá của hệ xúc tác tối ưu khi thay đổi hàm lượng

xúc tác

STT Hệ xúc tác (Ge–His)–He Hàm lượng xúc tác (%) Hàm lượng Ge–Tyr (%) Hàm lượng H2O2 (%) Hàm lượng H2O (%) 1

Hệ xúc tác tối ưu 0,04 15 Hàm lượng tối ưu W 2 0,06 3 0.08 4 0,1

Trong đó: W là hàm lượng nước trong mẫu tạo hydrogel và

W = 100% – (hàm lượng Gel–Tyr) – (hàm lượng xúc tác) – (hàm lượng H2O2) Tiến hành cố định hàm lượng H2O2 (hàm lượng tối ưu), hàm lượng nước, hàm lượng chất nền Ge–Tyr (15 %) để khảo sát hàm lượng xúc tác tối ưu. Tiến hành khảo sát: cho vào eppendorf Ge–Tyr hàm lượng 15 % cùng hệ xúc tác Ge–His–He (hệ xúc tác có hoạt lực cao nhất) ở các hàm lượng lần lượt là 0,04 %, 0,06 %, 0.08 %, 0.1 %, thêm nước và đánh votex cho hỗn hợp đồng nhất. Khi hỗn hợp đã tan hoàn toàn, tiến hành thêm lượng H2O2 đã tối ưu và tiếp tục đánh votex đồng thời ghi nhận thời gian. Thời gian gel hoá được xác định từ khi thêm H2O2 đến khi gel bắt đầu hình thành. Hàm lượng xúc tác có thời gian gel hoá thấp nhất là hàm lượng tối ưu và được sử dụng để tiến hành các khảo sát tiếp theo. Từ hai phép khảo sát thời gian gel hoá khi

thay đổi hàm lượng H2O2 và hàm lượng xúc tác, ghi nhận được các hàm lượng tối ưu của H2O2 và xúc tác trong phản ứng.

2.6.3. Đánh giá khả năng tạo hydrogel của hệ xúc tác Gelatin–Histamine–Hemin, Hemin–NaOH và Horseradish Peroxidase enzyme

Cho vào eppendorf Ge–Tyr hàm lượng 15 % cùng hệ xúc tác (thực hiện đồng thời ở ba hệ xúc tác) ở hàm lượng tối ưu, thêm nước và đánh votex cho hỗn hợp đồng nhất. Khi hỗn hợp đã tan hoàn toàn, tiến hành thêm lượng H2O2 đã tối ưu và tiếp tục đánh votex đồng thời ghi nhận thời gian. Thời gian gel hoá được xác định từ khi thêm H2O2 đến khi gel bắt đầu hình thành. Từ cơ sở đó đánh giá thời gian gel hoá của ba hệ xúc tác và so sánh lẫn nhau đồng thời đánh giá khả năng thay thế HRP của hệ xúc tác Ge–His–He trong phản ứng xúc tác tạo liên kết ngang tạo hydrogel.

Bảng 2.9. Khảo sát thời gian gel hoá của ba hệ xúc tác ở các điều kiện tối ưu

Hệ xúc tác Hàm lượng xúc tác (%)

Hàm lượng H2O2 (%)

Hàm lượng chất nền Gel–Tyr

(%)

HRP

Hàm lượng tối ưu Hàm lượng tối ưu 15

Ge–His–He

He–Na

2.7. Các phương pháp phân tích sản phẩm 2.7.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H–NMR)

Có nhiều loại hạt nhân hoạt động bằng cách tự xoay xung quanh trục của nó. Do các hạt nhân mang điện tích dương nên khi chúng xoay chuyển như thế sẽ giống như những thanh nam châm nhỏ và vì vậy chúng sẽ tương tác với từ trường bên ngoài (gọi là từ trường H0). Không phải tất cả các hạt nhân mà chỉ có một vài hạt nhân có đặc trưng này, trong đó có hạt nhân proton 1H và hạt nhân 13C.

Nếu khơng có sự tác động của từ trường bên ngồi thì các spin hạt nhân của những hạt nhân có từ tính sẽ định hướng theo vơ số phương. Khi mẫu chất khảo sát