Phương trình phản ứng giữa Gel–His và He

Hình 3.6. Phổ hồng ngoại của (A) Ge–His, (B) He và (C) hệ xúc tác Ge–His–He

Kết quả FT–IR của ba hợp chất là Ge–His, He và hệ xúc tác Ge–His–He được thể hiện trong Hình 3.6. Phổ hồng ngoại của He thể hiện các đỉnh hấp thụ đặc trưng tại 1702 cm–1 đặc trưng cho dao động giãn của nhóm carboxylic (nhóm COOH). Đỉnh hấp thụ tại 1456 và 1400 cm–1 đặc trưng cho các dao động trong vòng Pyrrole. Đỉnh hấp thụ tại 848 cm–1 đặc trưng cho dao động của liên kết =CH trong vòng Porphyrin [46, 47].

Hệ xúc tác Ge–His–He được tạo thành bằng quá trình tạo phức giữa liên kết N– H của His với ion sắt (III) ở tâm vòng Porphyrin của He. Phổ hồng ngoại của sản phẩm thu được cũng gồm đầy đủ các đỉnh hấp thụ đặc trưng của hai tiền chất, tuy nhiên cũng có một vài sự thay đổi trong phổ. Đầu tiên, dải hấp thụ từ khoảng 3450– 3380 cm–1 (do dao động giãn của liên kết N–H trong nhóm NH2 và NH) của Ge–His được mở rộng. Thứ hai, xuất hiện đỉnh hấp thụ tại 841 cm–1. Cả hai điều trên được giải thích bằng việc hình thành liên kết phức giữa He (tâm sắt trong vòng porphyrin) và Ge–His (liên kết N–H trong vòng Pyrrole), làm giảm lượng liên kết N–H trong cấu trúc của His và xuất hiện các dao động đặc trưng trong vòng Porphyrin của He.

Hình 3.7. Phổ Raman của Ge–His, He và hệ xúc tác Ge–His–He

Kết quả Raman của He, Ge–His và hệ xúc tác Ge–His–He được thể hiện trên Hình 3.7. Quang phổ Raman của He thể hiện các đỉnh đặc trưng ứng với từng dao động của các liên kết trong cấu trúc của He. Đỉnh hấp thụ tại 1369 cm–1 đặc trưng cho dao động giãn đối xứng của một nửa vòng pyrrole của hệ thống vòng protoporphyrin (IX). Đỉnh hấp thụ tại vị trí số sóng 1560 và 1612 cm–1 do dao động giãn bất đối xứng của liên kết C–C [48].

Hệ xúc tác Ge–His–He được tạo thành bằng quá trình tạo phức giữa liên kết N– H của His với ion sắt (III) ở tâm vòng Porphyrin của He. Quang phổ Raman của hệ sản phẩm có đầy đủ các đỉnh hấp thụ của hai tiền chất (He và hệ Ge–His), tuy nhiên có sự dịch chuyển đỉnh hấp thụ. Cụ thể là ba đỉnh đặc trưng của He là 1369, 1560, 1612 cm–1 bị dịch chuyển đỉnh hấp thụ ở số sóng lần lượt là 1370, 1571, 1627 cm–1 trong phổ của hệ sản phẩm Ge–His–He. Sự dịch chuyển đỉnh chứng minh rằng có sự tạo liên kết giữa hai tiền chất (liên kết phức giữa hệ Ge–His và He).

Như vậy, các đặc trưng của phổ FT–IR và Raman cho thấy rằng hệ xúc tác Ge– His–He đã được tổng hợp thành công.

Hình 3.8. Bước sóng hấp thụ của He ở các nồng độ khác nhau trong môi trường

đệm PBS pH 10

Hình 3.9. Bước sóng hấp thụ của He, Ge–His và hệ xúc tác Ge–His–He trong môi

Hiệu suất tổng hợp và hiệu suất mang He được xác định bằng phương pháp đo độ hấp thụ UV–Vis của He trong môi trường đệm PBS pH 10. Hình 3.8 thể hiện bước sóng hấp thụ của Hemin ở các nồng độ khác nhau. Nồng độ He lần lượt thay đổi từ 5–20 ppm cho thấy độ hấp thu thay đổi nhiều nhất tại bước sóng 385,5 nm. Tiến hành quét bước sóng hấp thụ của hệ xúc tác Ge–His–He thu được kết quả ở Hình 3.9. Độ hấp thụ của hệ sản phẩm tại vị trí bước sóng 389,5 nm, tuy nhiên trong khoảng 385– 389,5 nm không có sự chênh lệch đáng kể về độ hấp thu. Vì vậy, chọn độ hấp thu tại bước sóng 385,5 nm để tiến hành dựng đường chuẩn và đo hiệu suất phản ứng He lên hệ Ge–His trong môi trường đệm PBS pH 10 là hoàn toàn phù hợp.

Hình 3.10. Phương trình đường chuẩn của He trong môi trường đệm PBS pH 10

Hình 3.10 thể hiện phương trình đường chuẩn của He trong môi trường đệm PBS pH 10. Tiến hành đo hiệu suất phản ứng và hiệu suất mang He ở nồng độ mẫu cố định 25 ppm và ghi nhận độ hấp thụ tại bước sóng 385,5 nm. Dựa vào phương trình đường chuẩn, kết quả hiệu suất tổng hợp và hiệu suất mang He được thể hiện ở Hình 3.11.

Hình 3.11. Hiệu suất tổng hợp của hệ xúc tác Ge-His-He [H (%)] và hiệu suất mang

He [C (%)]

Hình 3.11 thể hiện hiệu suất tổng hợp của hệ xúc tác Ge-His-He và hiệu suất mang He. H (%) biểu thị cho hiệu suất tổng hợp hệ xúc tác Ge–His–He (lượng He tham gia phản ứng tạo phức với hệ Ge-His). C (%) biểu thị cho hiệu suất mang He (hàm lượng He trong cả hệ xúc tác Ge-His-He). Nhìn chung, C (%) thể hiện xu hướng tăng dần khi tăng hàm lượng He đưa vào hệ Ge–His. Mẫu ở tỉ lệ 1:1 có giá trị C (%) cao nhất và đạt 25.91 %, mẫu ở tỉ lệ 1:0,25 có giá trị C (%) thấp nhất và đạt 12,6 %. Trong khi đó, H (%) lại thể hiện xu hướng ngược lại, cụ thể là khi tăng dần lượng He thì H (%) giảm dần. H (%) đạt giá trị cao nhất và thấp nhất lần lượt ở hai tỉ lệ là 1:0,25 và 1:1. Đối với một hệ xúc tác được đánh giá là tối ưu khi giá trị H (%) và C (%) đạt giá trị lớn nhất và độ chênh lệch giá trị giữa hai thông số trên phải nhỏ nhất. Đối với mẫu ở hai tỉ lệ 1:0,75 và 1:1, khi so sánh giá trị C (%) giữa hai tỉ lệ thì sự chênh lệch nhỏ, (khoảng 1%) không đáng kể. Khi so sánh giá trị H (%) giữa hai tỉ lệ thì tỉ lệ 1:0,75 có giá trị H (%) cao hơn hẳn so với tỉ lệ 1:1 (chênh lệch khoảng 6 %). Từ đó, bước đầu có thể nhận định rằng hệ xúc tác với tỉ lệ 1:0,75 là tối ưu nhất trong bốn tỉ lệ đã tổng hợp.

3.2. Đánh giá hoạt lực trên Guaiacol

Việc đánh giá hoạt lực của hệ xúc tác trên GA dựa trên cơ sở sau: bản chất của các phản ứng enzyme là khi có sự tham gia xúc tác của các enzyme, các cơ chất sẽ được hoạt hóa mạnh, từ đó làm thay đởi tính chất hóa học của cơ chất, kết quả sau phản ứng sẽ tạo ra những sản phẩm của phản ứng. Dưới tác dụng của enzyme cơ chất có thể có những thay đởi khơng chỉ về cấu trúc hóa học, mà còn thay đởi tính chất hóa học. Q trình xúc tác của enzyme xảy ra qua ba giai đoạn:

Giai đoạn thứ nhất: Enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng những liên kết yếu,

nhờ đó sẽ tạo ra phức hệ enzyme–cơ chất. Phức hệ này thường không bền. Phản ứng tạo ra phức hệ enzyme–cơ chất thường xảy ra rất nhanh và đòi hỏi một ít năng lượng.

Giai đoạn thứ hai: Khi cơ chất tạo phức với enzyme sẽ bị thay đởi cả cấu hình

khơng gian, cả về mức độ bền vững của các liên kết. Kết quả là các liên kết bị phá vỡ và tạo ra sản phẩm.

Giai đoạn thứ ba: Đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm quá trình phản ứng

được tạo thành và tách ra khỏi enzyme.

Cơ chế xúc tác tổng quát của enzym được trình bày như sau:

E + S ES E + P (1) Năm 1913, hai nhà khoa học Leonom Michaelis và Maud Menten đưa ra mô hình động học để giải thích phản ứng được xúc tác bởi enzyme và lập phương trình phản ánh quan hệ giữa vận tốc phản ứng với nồng độ cơ chất và enzyme. Theo mơ hình này, enzyme và cơ chất sẽ kết hợp với nhau, tạo nên phức hợp enzym–cơ chất (ES). Phức hợp ES sẽ lại được chuyển hóa tiếp tục để tạo thành sản phẩm (P) và giải phóng enzyme (E). Enzyme được giải phóng lại thực hiện những phản ứng mới.

Hai nhà khoa học trên đã đưa ra mơ hình chuyển hóa trong phản ứng enzyme với một cơ chất duy nhất như sau:

E + S ES ES E + P (2)

trong đó: K1, K2, K3, K4, ... là những hằng số vận tốc của các phản ứng tương ứng; K4 là hằng số vận tốc phản ứng tạo ES từ P và E nhỏ nhất. Ngồi ra, từ mơ hình trên, phản ứng chuyển hóa từ ES → P + E là phản ứng quan trọng nhất, quyết định tồn bộ q trình chuyển hóa S → P.

K4 K2

K3 K1

Vận tốc của phản ứng ES → P + E tỷ lệ với nồng độ ES. Khi nờng độ ES càng cao thì vận tốc phản ứng càng cao.

V = K2[ES] (3)

Giả sử nồng độ enzyme ban đầu được ký hiệu là [E]; nồng độ phức enzyme–cơ chất là [ES]; nồng độ enzyme tự do khi phản ứng đạt được điểm cân bằng là [E]. Ta sẽ có:

[E] = [E] – [ES] (4)

Nếu ta giả sử nồng độ cơ chất ban đầu (cũng là nồng độ cơ chất trạng thái cân bằng của phản ứng thì sẽ thấy rằng nờng độ cơ chất thường lớn gấp nhiều lần so với enzyme.

Ở giai đoạn đầu của phản ứng, nếu nờng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng enzyme sẽ phụ thuộc tuyến tính với nờng độ cơ chất. Ta có thể tính được vận tốc phản ứng trong trường hợp như sau:

Vận tốc phản ứng thuận: V1 = K1[ES][S] (5)

Vận tốc phản ứng nghịch: V2 = K2[ES][S] (6)

Vận tốc phản ứng tạo ra sản phẩm: V3 = K3[ES][S] (7)

Trong giai đoạn cân bằng, sự phân ly ES sẽ cân bằng với sự tạo ra ES. Khi đó vận tốc phản ứng sẽ là:

V1 = V2 + V3 (8)

Thay (5) (6) (7) vào (8), ta có:

K1 ([E0] – [ES]) [S] = (K2 + K3) [ES] (9) Từ (9) ta có:

[ES] = K1 [E0][S]

K1[S]+[K2+ K3] (10) Nếu chia hai vế cho K1, thay K2 + K3, bằng hằng số Michaelis–Menten Km, ta sẽ có:

[ES] = [E0][S]

K𝑚+ [S] (11)

Thay [ES] vào phương trình (7) ta sẽ có:

[V0] = K1[E0][S]

Km+ [S] (12)

Khi nồng độ cơ chất đủ lớn sao cho tất cả nồng độ enzyme đều tham gia phản ứng để tạo ra phức hợp enzyme–cơ chất, ta có:

[ES] = [E0] (13) Theo lý thuyết, phản ứng sẽ tạo ra được vận tốc cực đại

Vmax = K3[E0] (14)

Từ đó, ta có thể thiết lập được cân bằng:

[V0] = Vmax[S]

Km+ [S] (15)

Phương trình (15) được coi là phương trình Michaelis–Menten. Phương trình này phản ánh tương quan định lượng giữa tốc độ ban đầu của phản ứng và tốc độ tối đa Vmax, nồng độ cơ chất ban đầu [S] và hằng số Km. Theo phương trình (15) thì V0 = Vmax/2, ta có:

Vmax

2 = Vmax

Km+ [S] (16)

Chia hai vế phương trình (16) cho Vmax ta sẽ có:

Vmax

2 = Vmax

Km+ [S] (17)

Từ phương trình (17) ta có:

Km + [S] = 2[S] và K = [S] khi V0 = Vmax/2 (18)

Từ phương trình (18) ta xây dựng được đồ thị phản ánh ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến vận tốc ban đầu của phản ứng.

Người ta dễ dàng xác định được Km và Vmax bằng cách nghịch đảo cả hai vế của phương trình Michaelis–Menten:

1

V0 = Km+ [S]

Vmax [S] (19)

Năm 1934 Lineweaver và Burk đưa ra phương trình từ phương trình (19):

1

V0 = Km

Vmax × 1

[S] + 1