Sơ đờ tởng hợp để hình thành Ge–Ph sử dụng EDC và NHS

Hình 1.28. Ảnh chụp dung dịch Ge 3% (w/v) và Ge–Ph (a) trước và (b) sau khi

thêm HRP và H2O2 lần lượt ở 1 đơn vị/mL và 10 mM. Các hủ bi ở (b) được ủ trong 2 ngày ở 37oC [28]

Năm 2016, Trinh H. T. N. đã tổng hợp hydrogel nhạy nhiệt từ Ge –pluronic

F127 thông qua việc ghép pluronic F127 đã được hoạt hóa và Ge. Curcumin được điều chế dạng nano trong môi trường phân tán là hydrogel Ge –pluronic F127 dưới tác dụng của sóng siêu âm để cải thiện tính tan tốt trong nước của curcumin và tạo ra hiệu quả cộng hợp dẫn truyền curcumin, góp phần tăng nhanh quá trình chữa lành vết thương. Cấu trúc của hydrogel được xác định bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H– NMR, đặc tính nhạy nhiệt của hydrogel được xác định bằng phương pháp đảo ngược ống nghiệm (inversion tube) và nhiệt quét vi sai (DSC). Hydrogel tởng hợp có khả năng chuyển đổi trạng thái sol–gel theo nhiệt độ, khi ở nhiệt độ thấp hydrogel Ge – pluronic F127 sẽ tồn tại ở trạng thái lỏng khi nâng nhiệt độ lên 35oC (gần nhiệt độ cơ

thể) sẽ chuyển thành màng gel. Kích thước hạt nano curcumin trong hydrogel được xác định bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và tán xạ ánh sáng động học (DLS) cho thấy hạt nano phân bố từ 7 đến 285 nm tùy hàm lượng curcumin sử dụng. Khả năng mang nhả chậm nano curcumin được xác định bằng phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến UV–Vis, kết quả cho thấy hệ gel có khả mang nhả chậm nano curcumin hiệu quả. Tính chất nhạy nhiệt của hydrogel Ge –pluronic F127 không thay đổi khi tải thêm hạt nano curcumin. Trong nghiên cứu in vitro cho thấy rằng ở khoảng nờng độ nanocurcumin thích hợp hệ gel composite hỡ trợ tốt cho sự tăng sinh nguyên bào sợi. Có thể kết luận rằng hydrogel Ge–pluronic F127 nhạy nhiệt có khả năng mang nhả chậm nano curcumin và có tiềm năng ứng dụng trong việc chữa lành vết thương [29].

1.4. Cơ sở, mục tiêu và ý nghĩa khoa học của đề tài 1.4.1. Cơ sở của đề tài

Cấu trúc của HRP bao gồm một tâm sắt (hay còn được gọi là tâm hoạt tính), HRP có được khả năng oxy hoá và hoạt tính xúc tác là nhờ vào tâm sắt này. Ngoài ra, trong cấu trúc còn có các thành phần peptide và đặc biệt là một cầu nối phối trí imidazole giúp HRP tan được trong nước và tăng hoạt tính của HRP. Tuy nhiên, HRP là một enzyme tự nhiên cho nên việc phân lập rất khó và tốn nhiều chi phí nên giá thành rất cao. Ngoài ra, nó còn không ổn định và được chứng minh là dễ dàng bị mất hoạt tính khi ở trong môi trường có nồng độ H2O2 cao [7]. Từ đó, yêu cầu đặt ra là phải tổng hợp được một loại enzyme thoả mãn hai yếu tố. Thứ nhất, phải có hoạt tính xúc tác tương tự với HRP. Thứ hai, phải có độ ổn định cao và không bị mất hoạt tính. Nhận thấy, He là một trong những hợp chất có đặc điểm cấu trúc và khả năng xúc tác tương tự với HRP. He là một nguồn nguyên liệu rẻ tiền và việc sử dụng He khắc phục được các nhược điểm của HRP đã đề cập trước đó. Tuy nhiên, HRP có được sự hiệp trợ từ các thành phần peptide và cầu nối phối trí imidazole, vì vậy nó rất dễ tan trong dung dịch ở các điều kiện pH khác nhau. Còn đối với He, do tính kỵ nước của cấu trúc hydrocarbon và hoản toàn không có các thành phần peptide hay cầu nối phối trí imidazole hiệp trợ nên He chỉ tan được trong môi trường kiềm, từ đó làm giảm khả năng thay thế HRP.

Dựa trên đặc điểm cấu trúc của HRP và He, các nghiên cứu gần đây cho thấy việc biến tính He nhằm cải thiên độ hoà tan của nó trong môi trường nước trung tính đang được quan tâm. Các nghiên cứu này chủ yếu đưa các polymer hoặc protein có nguồn gốc từ thiên nhiên gắn lên He nhằm mục đích biến tính cấu trúc của He gần

giống với cấu trúc của HRP và cho kết quả vô cùng khả quan. Sản phẩm sau khi biến tính đều có khả năng hoà tan trong nước, có độ linh hoạt cao, hoạt tính xúc tác cao hơn Hemin nguyên chất và hoàn toàn có khả năng thay thế HRP.

Trong lĩnh vực y sinh thì đòi hỏi xúc tác (enzyme) phải thoả mãn các yếu tố như: không độc hại, tương thích sinh học tốt và có khả năng phân huỷ sinh học. Gelatin (Ge) là một protein tự nhiên có các đặc tính vượt trội như:

+ Dễ hoà tan trong các khoảng pH rộng

+ Tương thích sinh học và có khả năng phân huỷ sinh học + Không độc hại

+ Trong cấu trúc còn có các nhóm chức năng hoạt động nên dễ dàng biến tính hoá học

Tuy nhiên, để biến tính cấu trúc của He giống với cấu trúc của HRP thì vẫn còn thiếu một cầu nối phối trí imidazole. Cho nên trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn biến tính Hemin bằng Ge (cung cấp các thành phần peptide) và His (cung cấp cầu nối phối trí imidazole).

1.4.2. Mục tiêu và ý nghĩa khoa học của đề tài

Mục tiêu: Giả cấu trúc của enzyme HRP bằng He biến tính bằng Ge và His. Ý nghĩa khoa học: Tạo ra một loại enzyme có hoạt tính tương tự với HRP, tuy

nhiên ổn định hơn và không bị mất hoạt tính trong môi trường có nồng độ H2O2 cao. Ngoài ra, giá thành của HRP rất cao, He lại là nguồn nguyên liệu rẻ tiền. Cho nên việc tổng hợp hệ xúc tác Ge–His–He thành công mang lại hiệu quả không chỉ về kinh tế mà còn khắc phục được các nhược điểm của HRP đã nêu ra trước đó.

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. Hoá chất và thiết bị sử dụng trong thực nghiệm 2.1. Hoá chất và thiết bị sử dụng trong thực nghiệm

2.1.1. Hoá chất

Bảng 2.1. Danh mục các hoá chất được sử dụng

Hoá chất Nguồn gốc

Gelatin từ da heo 99 % (Ge) Merck, Đức

Histamine 99 % (His) Acros organics, Hoa Kỳ

Hemin 97 % (He) Sigma–Aldrich, Hoa Kỳ

1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)- Carbodiimide 98 % (EDC)

Acros organics, Hoa Kỳ

N-Hydroxysuccinimide 98 % (NHS ) Acros organics, Hoa Kỳ

Hydrogen peroxide (H2O2) Acros organics, Hoa Kỳ

Hydrochloric acid (HCl) Merck, Đức

Sodium hydroxide 99 % (NaOH) Merck, Đức

Horseradish peroxidase 5 kU (HRP) Sigma–Aldrich, Hoa Kỳ

Guaiacol 99 % (GA) Acros organics, Hoa Kỳ Pyrogalol 99 % (PGL) Sigma–Aldrich, Hoa Kỳ

Monopotassium phosphate 99,5 % (KH2PO4)

Merck, Đức

Polymer Gelatin-Tyramine (Ge-Tyr) Phòng Vật liệu Hoá dược, Viện Khoa

2.1.2. Thiết bị và dụng cụ

Bảng 2.2. Danh mục dụng cụ và thiết bị sử dụng

Thiết bị Nguồn

Màng thẩm tách Spectra/Por, MWCO

12-14 kD Spectrumlabs - Mỹ

Ống nghiệm nhựa dạng eppendorf có

nắp đậy (5 mL) Duran - Đức

Cân phân tích (Nhật) Phòng Vật Liệu Hóa Dược

Máy khuấy từ gia nhiệt (Mỹ) Phòng Vật Liệu Hóa Dược

Máy đánh Votex (Trung Quốc) Phòng Vật Liệu Hóa Dược

Máy đông khơ chân khơng (Nhật) Phịng Vật Liệu Hóa Dược

Bể siêu âm (Hàn Quốc) Phòng thí nghiệm FM&D

Quang phổ kế hồng ngoại biến đổi Fourier FTIR Equinox 55 Bruker

(Đức)

Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng TP.HCM

Thiết bị quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến (UV-Vis) (Nhật)

Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng TP.HCM

Hệ đo kính hiển vi quang phổ tán xạ Raman XploraONE/HORIBA (Nhật)

Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng TP.HCM

Thiết bị phổ 1H-NMR đo trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker

Avance 500 (Đức)

2.2. Tổng hợp hệ xúc tác Gelatin–Histamine–Hemin 2.2.1. Tổng hợp Gelatin–Histamine

v