Khả năng xúc tác của HRP ở các nồng độ H2O2 khác nhau

Hình 3.16 thể hiện khả năng xúc tác của hệ Ge–His–He 1:0,75 ở các nồng độ H2O2 khác nhau (từ 2–100 mM). Nhận thấy rằng khi nồng độ H2O2 càng cao thì hoạt tính xúc tác của hệ càng cao, đạt giá trị lớn nhất và nhỏ nhất lần lượt tại nồng độ H2O2 tương đương là 100 mM và 2 mM. Nhìn chung, hệ Ge–His–He 1:0,75 có xu hướng

k1

khi càng tăng nồng độ H2O2 thì khả năng xúc tác của hệ càng tăng. Điều này cho thấy rằng hệ có khả năng xúc tác ổn định trong môi trường nồng độ H2O2 cao.

Hình 3.17 thể hiện khả năng xúc tác của hệ enzyme HRP ở các nồng độ H2O2 khác nhau (từ 2–100 mM). Khi thay đổi nồng độ H2O2 nhận thấy rằng khi nồng độ H2O2 càng cao thì hoạt tính xúc tác của HRP càng cao, tuy nhiên có sự khác biệt rõ rệt tại vị trí nồng độ H2O2 10 mM. Cụ thể rằng khi tăng nồng độ H2O2 từ 2mM đến 10 mM, hoạt tính xúc tác của HRP vẫn tăng dần, tuy nhiên từ 10–100 mM thì hoạt tính xúc tác của HRP giảm đi rõ rệt. Điều này cho thấy rằng HRP bị mất hoạt tính (bất hoạt) khi ở trong môi trường H2O2 nồng độ cao, vì thế nồng độ H2O2 tối ưu để khảo sát các tính chất của HRP thường là dưới 10 mM.

HRP bị mất hoạt tính trong môi trường H2O2 nồng độ cao đã được chứng minh trước đó [21]. Tóm tắt các phản ứng quan trọng tạo nên chu trình xúc tác HRP với sự có mặt của các hợp chất vòng thơm được trình bày trong Hình 4.16. Các phản ứng trong chu trình xúc tác sơ cấp được đưa ra bởi cơ chế Chance–George, trong đó HRP bị oxy hóa bởi hydrogen peroxide (H2O2) và đi từ trạng thái ban đầu (HRP) qua hai dạng hoạt động xúc tác được gọi là hợp chất I (EI) và II (EII), trước khi trở lại dạng ban đầu. Mỗi hợp chất hoạt động này sẽ oxy hóa cơ chất có vòng thơm (AH2) để tạo ra gốc tự do (·AH)

HRP + H2O2 HRPi + H2O (1)

HRPi + AH2 HRPii + ·AH (2)

HRPii + AH2 HRP + ·AH + H2O (3) ·AH +·AH sản phẩm polyaromatic (4)

Các polyaromatic (polymer tạo thành từ sự kết hợp của các vòng thơm) này ít hòa tan hơn các tiền chất đơn phân của chúng và có xu hướng kết tủa trong dung dịch. Các polymer có khả năng hòa tan vẫn trải qua q trình oxy hóa tiếp tục dẫn đến sự hình thành các polymer có khối lượng phân tử cao hơn và độ tan tiếp tục giảm. Trong khi các phản ứng này chiếm ưu thế trong hỗn hợp peroxide, hợp chất vòng thơm và HRP xuất hiện sự cạnh tranh với vai trị vơ hiệu hóa hoặc ức chế chức năng của enzyme. Sự ức chế hoạt động của enzyme, hoặc sự bất hoạt, là kết quả khi hợp chất II bị oxy hóa bởi H2O2 để tạo ra một dạng enzyme hầu như không hoạt động được gọi là hợp chất III.

k4 k3 k2

Hình 3.18. Chu trình xúc tác HRP được đơn giản hóa – các phản ứng quan trọng

xảy ra khi có mặt của một cơ chất có vòng thơm (trường hợp này sử dụng phenol làm cơ chất) [7]

HRPii + H2O2 HRPiii + H2O Phần lớn sự bất hoạt vĩnh viễn của enzyme được cho là kết quả của sự tương tác giữa enzyme và các gốc tự do, các polymer của enzyme và sản phẩm cuối cùng. Sự bất hoạt bởi các gốc tự do được cho là do những liên kết này tương tác với biên heme của enzyme và phá vỡ tâm hoạt động. Phản ứng này có thể được viết là:

HRPhoạt động + ·AH HRP không hoạt động

Trong đó HRP hoạt động đại diện cho tất cả các dạng enzyme chưa bị bất hoạt vĩnh viễn và HRP không hoạt động đại diện cho HRP bất hoạt vĩnh viễn. Sự bất hoạt bởi polymer xảy ra khi HRP bị hấp thụ vào các sản phẩm phản ứng khi chúng hình thành. Khơng có nghiên cứu nào trước đây mơ tả những hiện tượng này một cách định lượng. Các phản ứng phụ khác của HRP, bao gờm sự hình thành verdohemoprotein khơng hoạt động và tiêu thụ peroxide thông qua hoạt động catalase của HRP, có thể xảy ra song song với các phản ứng được thể hiện trong Hình 3.14. Tuy nhiên, nhận thấy rằng khi có mặt chất vòng thơm, những phản ứng phụ này là tối

thiểu so với các phản ứng khác và có thể bị bỏ qua khi lập mơ hình hệ thống. Do đó, chúng khơng được xem xét trong q trình phát triển mơ hình sau đó [7].

Hình 3.19. Khả năng xúc tác của HRP và hệ xúc tác Ge–His–He 1:0,75 ở các nồng

độ H2O2 khác nhau

Để thuận tiện trong việc so sánh khả năng xúc tác của hệ Ge–His–He và HRP, ta quy đổi về giá trị V/Vmax – giá trị hoạt tính tương đối của enzyme. Hình 3.15 so sánh khả năng xúc tác giữa HRP và hệ Ge–His–He 1:0,75 ở các nồng độ H2O2 khác nhau theo thời gian. Khi tăng nồng độ H2O2 từ 2 mM–10 mM, enzyme HRP có giá trị V/Vmax tăng mạnh từ 0,72–0,92. Khi tăng từ 10–100 mM, hoạt tính của HRP giảm rõ rệt từ 0,92–0,14. Điều này được giải thích HRP bị ức chế trong môi trường có nồng độ H2O2 cao. Đối với hệ Ge–His–He 1:0,75 khi tăng nồng độ H2O2 thì giá trị V/Vmax tăng dần. Từ đó bước đầu có thể kết luận rằng, hệ xúc tác Ge–His–He có hoạt tính ổn định hơn HRP trong môi trường nồng độ H2O2 cao.

3.4. Kết quả gây độc tế bào nguyên bào sợi

3.4.1. Kết quả theo phương pháp nhuộm Sulforhodamine B

Kết quả gây độc nguyên bào sợi (Fibroblast) bằng phương pháp nhuộm SRB được thể hiện trên Hình 3.20.