Thuyết minh quy trình
Cân chính xác 0,003g mẫu cao trích cho vào ống chiết thủy tinh. Cho 6ml dịch chiết ethanol vào ống thủy tinh. Đậy nắp và lắc đều ta được dung dịch mẫu có nồng độ 500μg/ml. Pha loãng theo các nồng độ 10, 25, 50, 100 với EtOH và DPPH. Mỗi nồng độ được lặp lại 3 lần. Nếu hoạt tính của mẫu thử mạnh sẽ thử tiếp các nồng độ thấp hơn 10; 5; 2; 1µg/ml. Ta được nồng độ 50μg/ml. Sau đó, để yên trong bóng tối 30 phút ở nhiệt độ phịng và đo mật độ quang tại bước sóng 519nm
0,003g cao trích
Đậy nắp, lắc đều 6ml EtOH
95%
Pha loãng theo các nồng độ EtOH 95% DPPH Để yên trong bóng tối 30 phút ở nhiệt độ phịng Đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 519nm
32
Tính kết quả
𝐈 (%) =𝐀𝐂− 𝐀𝐒
𝐀𝐂 × 𝟏𝟎𝟎% Trong đó:
AC - Gía trị mật độ quang của dung dịch khơng có mẫu cao (control) AS - Gía trị mật độ quang của dung dịch có mẫu cao (sample)
Mẫu control: Ta thay V1 (µl) bằng V2 (µl) EtOH
Mẫu blank: Được chuẩn bị tương tự mẫu sample nhưng ta thay VDPPH bằng VEtOH
Xác định IC50
IC50 là giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hay yếu của các mẫu cao. IC50 được định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do hoặc enzyme. Mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 càng thấp.
Tiến hành khảo sát hoạt tính của mẫu ở 4 nồng độ 100; 50; 25; 10µg/mL
Với những mẫu có hoạt tính biến thiên tuyến tính với nồng độ chúng ta vẽ một đường thẳng 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏 qua tất cả các điểm (với y là % ức chế và x là nồng độ).
Với những mẫu có hoạt tính khơng biến thiên tuyến tính với nồng độ một cách gần đúng chúng ta chọn 2 nồng độ ức chế trên và 2 nồng độ ước chế dưới 50% và cũng tiến hành vẽ đường thẳng 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏 ta sẽ thu được phương trình 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏 với 2 hệ số a b đã biết. Thay 𝑦 = 50% vào phương trình ta sẽ thu được giá trị x. Đó chính là nồng độ ức chế được 50% gốc tự do (IC50).
Địa điểm thực hiện: Phịng thí nghiệm trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Tp. Hồ Chí Minh. 2.3.2.3. Khả năng khử với Fe3+
Nguyên tắc
Sự khử Fe3+ thường được sử dụng như một chỉ thị cho khả năng cho electron – đây là một cơ chế chống oxy hóa quan trọng của phenolic (Yildirim A, 2001). Trong thí nghiệm này, sự hiện diện của chất chống oxy hóa trong các mẫu sẽ dẫn đến việc khử Fe3+ thành Fe2+ bằng cách cho một electron. Sau đó, hàm lượng phức Fe2+ được đo bằng các đo độ hấp thụ ở 700nm (Gupta, 2009)
33
Hình 2.4. Sơ đồ xác định khả năng khử với Fe3+ Thuyết minh quy trình
Phối trộn cao trích (2 mg/ml, 4 mg/ml, 6 mg/ml, 8 mg/ml, 10 mg/ml) lần lượt với đệm phosphate KH2SO4 – K2HSO4 (2,5 ml, 0,2 M, pH 6,6) và Kali ferricyanide (2,5 ml, 1%). Sau đó, hỗn hợp được ủ ở 50 oC trog 20 phút, tiếp theo phối trộn với 2,5 ml TCA 10% và li tâm 3000 rpm trong 10 phút. Cuối cùng sử dụng 2,5 ml phần dịch trên phối trộn với 2,5 ml
Cao trích FeCl3 Nước cất TCA K3[Fe(CN)6] Đệm phosphat Phối trộn Li tâm Ủ Phối trộn Phối trộn Đo độ hấp thụ
34
nước cất và 0,5 ml FeCl3 0,1% và đo độ hấp thụ ở bước sóng 700nm. Lưu ý: Mỗi nồng độ thực hiện 3 lần.
Xác định EC50
EC50 là giá trị được dùng để xác định năng lực khử mạnh hay yếu của các mẫu cao. EC50 được định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đó độ hấp thụ quang là 0,5.
Địa điểm thực hiện: Phịng thí nghiệm trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Tp. Hồ Chí Minh. 2.3.2.4. Khả năng ức chế enzyme tyrosinase
Nguyên tắc:
Trong môi trường đệm pH=6,8, enzym tyrosinase sẽ chuyển hóa L-DOPA thành DOPAchrom có màu đỏ cam có độ hấp thu cực đại tại bước sóng λmax= 475 nm. Các mẫu khảo sát hoạt tính ức chế enzym tyrosinase sẽ làm giảm họat tính xúc tác của enzym dẫn đến cường độ màu sẽ bị giảm đi.
L-DOPA DOPAchrom λmax= 475 nm