38 Quy trình Hình 2.8. Quy trình thử độc tính tế bào Hút bỏ Mơi trường Rửa PBS Hòa tan formazan DMSO Đo mật độ quang ở 550nm Ủ lần 1 Ủ lần 2 Thuốc thử MTT Tế bào B16 Nuôi cấy Hút bỏ Mơi trường Thử nghiệm Cao trích Chuẩn bị ở các nồng độ khác nhau
39
Thuyết minh quy trình
Tế bào hắc sắc tố ung thư từ chuột (Mouse B16 melanoma cell) được cung cấp từ phịng thí nghiệm sinh học phân tử và mơi trường thuộc Đại học Khoa học tự nhiên Tp.Hồ Chí Minh. Tế bào được ni cấy trong môi trường Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) có bổ sung 10% huyết thanh thai bò (FBS), 1% kháng sinh Streptomycin/Penicilin ở điều kiện 37ºC, 5% CO2. Tiến hành cấy truyền khi độ che phủ của tế bào trên bề mặt flask trên 80%. Mật độ tế bào được đếm bằng buồng đếm hồng cầu để tính số lượng tế bào cần thiết cho thí nghiệm.
Sau khi tế bào được ni cấy, tế bào B16 được nuôi trong đĩa 96 giếng với mật độ 104 tế bào/giếng ở điều kiện 37ºC, 5% CO2. Đồng thời, cao trích được pha với Dimethyl sulfoxide (DMSO) và hịa vào mơi trường DMEM mới để đạt nồng độ 10µg/ml đến 120µg/ml cùng với blank là mơi trường ni cấy không tế bào và đối chứng là mơi trường chứa 1µl/ml DMSO. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Sau đó ta tiến hành thử nghiệm bằng cách hút bỏ môi trường cũ, bổ sung các mẫu thử vào mỗi giếng và ủ ở 37ºC, 5% CO2 trong 48 giờ. Sau 48 giờ, bổ sung 10µl thuốc thử MTT vào mỗi giếng và tiếp tục ủ ở 37ºC, 5% CO2 trong 3 giờ. Sau 3 giờ tiến hành hút bỏ mơi trường, rửa lại bằng PBS, bổ sung 100µl DMSO vào mỗi giếng và lắc đề trong 10 phút. Cuối cùng tiến hành đo quang ở 550nm.
Đánh giá kết quả
Phần trăm tế bào sống sót được tính theo cơng thức sau: 𝐏𝐡ầ𝐧 𝐭𝐫ă𝐦 𝐭ế 𝐛à𝐨 𝐬ố𝐧𝐠 𝐬ó𝐭 =𝐀𝐬
𝐀𝐜∗ 𝟏𝟎𝟎 Trong đó:
As: Giá trị đo quang của mẫu thử
Ac: Giá trị đo quang của mẫu control (mẫu khơng có mẫu thử)
Địa điểm thực hiện: Phịng thí nghiệm sinh học phân tử và mơi trường thuộc trường Đại
học Khoa học tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh.
2.4.2. Đánh giá tyrosinase nội bào và melanin nội bào Nguyên tắc Nguyên tắc
Sử dụng IBMX như một chất kích thích sinh tổng hợp melanin thơng qua con đường tín hiệu phụ thuộc cAMP (cAMP-dependent pathway) - con đường chính trong việc điều hịa hình thành sắc tố ở các tế bào melanocyte. Từ đó, hàm lượng melanin nội bào được xác định ở bước sóng 450nm và hoạt tính của enzyme tyrosinase nội bào được xác định thông qua phản ứng với cơ chất L-DOPA (Lin, 2011).
40 Quy trình DMEM Ủ Ly tâm Tế bào B16 Nuôi cấy Hút bỏ Môi trường Thử nghiệm Cao trích Chuẩn bị ở các nồng độ khác nhau Melanin nội bào Tyrosinase nội bào
Gia nhiệt NaOH 1N,
DMSO Đo mật độ quang ở 450nm Ủ lần 1 Ủ lần 2 Đệm Na- phosphate L-DOPA Đo mật độ quang ở 492nm
41
Thuyết minh quy trình
Tế bào B16 được ni trong đĩa 6 giếng với mật độ 2x105 tế bào/giếng với 2ml môi trường DMEM ở điều kiện 37ºC, 5% CO2 trong 24 giờ. Đồng thời, cao trích được pha với DMSO và hịa với mơi trường DMEM để đạt được các nồng độ 10µg/ml, 20µg/ml, 40µg/ml, cùng với đối chứng âm là mơi trường chứa 2µl/ml DMSO và đối chứng dương là Arbutin 2mM. Tiếp theo IBMX được cho vào mỗi giếng (trừ control) 100µM. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Sau đó, hút bỏ mơi trường cũ, bổ sung các mẫu thử vào mỗi giếng và ủ ở 37ºC trong 48 giờ. Sau 48 giờ tiến hành ly tâm 13000rpm, 20 phút ở 4ºC, cuối cùng thu tủa để đo hàm lượng melanin nội bào và phần dịch nổi thu lại để đánh giá tyrosinase nội bào.
Đánh giá melanin
Sau khi thu tủa vào các ống nghiệm thì bổ sung NaOH 1N 10% DMSO vào mỗi ống. Sau đó, mẫu được gia nhiệt ở 80oC đến khi hịa tan hồn tồn melanin và tiến hành đo mật độ quang ở 450nm.
Đánh giá tyrosinase nội bào
Đầu tiên ta lấy 70µl tyrosinase nội bào thu được trước đó vào ống nghiệm và ủ 5 phút ở 37ºC, sau đó cho vào 150µl đệm Na-phosphate 20mM, 150µl L-DOPA 10mM và ủ trong vịng 10 phút. Cuối cùng, đo mật độ quang tại bước sóng 492nm.
Đồng thời tiến hành đo mẫu blank khơng có cơ chất L-DOPA. Mẫu này ta tiến hành tương tự như trên nhưng thay 150µl L-DOPA 10mM bằng 150µl đệm Na-phosphate 20mM.
Địa điểm thực hiện: Phịng thí nghiệm sinh học và môi trường trường Đại học Khoa học tự
nhiên Tp. Hồ Chí Minh.
2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu trung bình, độ lệch chuẩn và sai số bằng phần mềm Excel 2016 (Microsoft Inc, Redmond, California, USA). Xử lý thống kê ANOVA được thực hiện bằng phần mềm SPSS (SPSS 20 for windows, SPSS Inc, Chicago, IL, 224 USA).
42
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Điều chế cao trích 3.1. Điều chế cao trích
3.1.1. Hiệu suất thu hồi cao trích (Phụ lục 1)
Hiệu suất thu hồi cao trích từ 5 loại nấm linh chi đỏ (G.lucidum) theo phương pháp ngâm dầm được trình bày ở Bảng 3.1. Kết quả cho thấy hiệu suất thu hồi của các mẫu có sự khác nhau, trong đó hiệu suất thu hồi của mẫu E-SH là cao nhất (11,12%) và thấp nhất là E-
NB (5,01%). Quá trình điều chế cao trích được tiến hành trong các điều kiện đồng nhất về
kích thước nguyên liệu, loại dung môi (ethanol), tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và nhiệt độ ngâm dầm nên sự hiệu suất thu hồi khác nhau là do sự khác nhau về các thành phần hóa học có trong nguyên liệu. Độ ẩm và các thành phần ưa nước có trong ngun liệu chính là các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi. Sự liên kết giữa nước, protein và các thành phần ưa nước khác làm ảnh hưởng đến sự dịch chuyển dung môi thấm sâu vào vật liệu, làm chậm quá trình khuếch tán và ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly (Lê Bạch Tuyết, 1996).
Bảng 3.1. Hiệu suất thu hồi của 5 mẫu cao (Phụ lục 1)
STT KÝ HIỆU TÊN MẪU THU SUẤT H(%)
1 E-VN Linh chi Việt Nam 6,23
2 E-HQ Linh chi Hàn Quốc 6,55
3 E-NB Linh chi Nhật Bản 5,01
4 E-HC Linh chi hồng chi 10,50
5 E-SH Linh chi sừng hươu 11,12
3.1.2. Độ ẩm cao trích (Phụ lục 2)
Cao trích được đo độ ẩm trước khi thực hiện các phương pháp thử nghiệm. Độ ẩm của các mẫu cao nấm linh chi đỏ được trình bày Bảng 3.2. Kết quả cho thấy độ ẩm của 5 loại cao trích có sự khác biệt đáng kể (P<0,05). Mẫu cao E-HQ có độ ẩm cao nhất (13,06%) và thấp nhất là mẫu E-SH (6,35%). Sự khác biệt này là do tính chất và thành phần hóa học có trong 5 loại nấm linh chi khác nhau ảnh hưởng đến q trình trích ly. Sau khi điều chế thành cao trích, thành phần trong các mẫu cao nấm linh chi đỏ khác nhau, tạo ra sự khác biệt về độ ẩm (Lê Bạch Tuyết, 1996).
43
Bảng 3.2. Độ ẩm 5 loại cao trích nấm linh chi
STT KÝ HIỆU TÊN MẪU ĐỘ ẨM CAO (%)
1 E-VN Linh chi Việt Nam 12,14±0,53a
2 E-HQ Linh chi Hàn Quốc 13,06±0,03b
3 E-NB Linh chi Nhật Bản 11,11±0,46c
4 E-HC Linh chi hồng chi 9,25±0,19d
5 E-SH Linh chi sừng hươu 6,35±0,21e
Các giá trị trong bảng biểu thị trung bình ± độ lệch chuẩn
Các giá trị (a-e) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (P<0.05)
3.1. Sàng lọc khả năng kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase 3.2.1. Xác định tổng hàm lượng polyphenol (Phụ lục 3) 3.2.1. Xác định tổng hàm lượng polyphenol (Phụ lục 3)
Bảng 3.3. Tổng hàm lượng polyphenol của 5 loại cao nấm linh chi (Phụ lục 2)
STT Ký hiệu Tên mẫu Tổng hàm lượng polyphenol
(mgGAE/g)
1 E-VN Linh chi Việt Nam 23,25±1,11a
2 E-HQ Linh chi Hàn Quốc 48,29±0,32b
3 E-NB Linh chi Nhật Bản 34,46±0,26c
4 E-HC Linh chi hồng chi 46,35±0,14d
5 E-SH Linh chi sừng hươu 46,76±0,49d
Các giá trị trong bảng biểu thị trung bình ± độ lệch chuẩn
Các giá trị (a-d) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (P<0.05)
Hàm lượng polyphenol được xem là một trong các cơ sở để đánh giá khả năng kháng oxy hóa. Kết quả hàm lượng polyphenol của 5 mẫu cao nấm linh chi đỏ được trình bày ở
Bảng 3.3. Các mẫu cao có sự khác biệt về hàm lượng polyphenol (P<0,05). Tổng hàm lượng
polyphenol của các mẫu dao động từ 23,25mgGAE/g đến 48,29mgGAE/g. Kết quả tương tự trong một nghiên cứu khác đã báo cáo rằng hàm lượng polyphenol của cao G.lucidum được trích bằng ethanol dao động trong khoảng 33,42 – 52,15mgGAE/g (Ćilerdžić, 2014). Qua thử nghiệm, mẫu cao E-HQ (48,29mgGAE/g) có hàm lượng cao nhất và thấp nhất là E-VN (23,25mgGAE/g). Hàm lượng polyphenol của G.lucidum có thể đạt tới 71,43mgGAE/g khi trích ly bằng ethanol (Imtiyaz, 2012). Khi sử dụng các loại dung mơi khác như hydroalcoholic, nước nóng để trích ly G.lucidum thì hàm lượng polyphenol lần lượt là 43,14mgGAE/g và 33,00mgGAE/g, hàm lượng thấp hơn so với trích ly bằng ethanol nhưng không đáng kể (Kozarski, 2012).
Trong nghiên cứu khác về khả năng chống oxi hóa của các loài thuộc giống
44
G.applanatum. Trong đó, hàm lượng polyphenol của hai lồi G. lucidum (9,00 mgGAE/gm)
và G.tsugae (9,00 mgGAE.gm-1) là như nhau và cao nhất là G.applanatum (11,6
mgGAE/gm) (Rajoriya, 2015). Tuy nhiên, G.applanatum có giá thành rất cao và có thể lên đến vài chục triệu/kg nên khó có thể ứng dụng rộng rãi.
Bên cạnh đó, Bảng 3.1 và Bảng 3.3 cho thấy được hiệu suất thu hồi của cao nấm
linh chi Hàn Quốc (6,55%) thấp hơn cao hồng chi Đà Lạt (10,5%) và sừng hươu (11,12%) nhưng lại có tổng hàm lượng polyphenol lớn nhất. Do đó, mẫu nấm linh chi Hàn Quốc có thể có khả năng kháng oxy hóa cao nhất.
3.2.2. Xác định hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH (Phụ lục 4)
Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do trình bày trong Bảng 3.4 và Bảng 3.5 thể hiện giá trị phần trăm ức chế và giá trị IC50 của gallic acid và 5 loại cao nấm linh chi đỏ.
Bảng 3.4. Phần trăm ức chế và giá trị IC50 của chất đối chứng dương gallic acid Mẫu Phần trăm ức chế trung bình (Imean %) IC50 Mẫu Phần trăm ức chế trung bình (Imean %) IC50
(𝛍𝐠/𝐦𝐥) 10𝛍𝐠/𝐦𝐥 5𝛍𝐠/𝐦𝐥 2,5𝛍𝐠/𝐦𝐥 1𝛍𝐠/𝐦𝐥
Gallic acid 70,18±1,09a 52,46±0,80b 34,56±1,85c 20,35±0,80d 5,62
Các giá trị trong bảng biểu thị trung bình ± độ lệch chuẩn
Các giá trị (a-d) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê giữa các nồng độ (P<0,05)
Bảng 3.5. Hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH (Phụ lục 3)
STT MẪU Phần trăm ức chế trung bình (Imean %) IC50 (𝛍𝐠/𝐦𝐥) 100𝛍𝐠/𝐦𝐥 50𝛍𝐠/𝐦𝐥 25𝛍𝐠/𝐦𝐥 10𝛍𝐠/𝐦𝐥 1 E-VN 60,82±0,65a 30,85±0,53a 12,33±0,11a 7,40±0,25a 82,48 2 E-HQ 80,88±0,23b 65,08±0,2b 33,53±0,35b 16,87±0,20b 47,49 3 E-NB 75,77±0,44c 50,44±0,00c 29,92±1,00c 13,00±0,67c 57,67 4 E-HC 73,69±0,93d 42,13±0,79d 15,74±0,78d 7,82±0,40a 66,39 5 E-SH 89,59±0,11e 69,07±0,85e 34,88±0,38e 21,20±0,11d 41,42
Các giá trị trong bảng biểu thị trung bình ± độ lệch chuẩn
Các giá trị (a-e) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê giữa các cao chiết trong cùng một nồng độ (P<0,05)
Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do là phương pháp phổ qt trong nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa và là một kỹ thuật nhanh chóng để sàng lọc khả năng ức chế gốc tự do của cao trích (Li, 2012).
Nhìn chung, các mẫu cao đều có hiệu suất trung hòa gốc tự do DPPH tăng dần theo nồng độ và cao nhất tại nồng độ 100μg/ml. Một nghiên cứu về khả năng ức chế gốc tự do của cao ethanol G.lucidum cho ra kết quả tương tự với phần trăm ức chế dao động 65 – 90% tại nồng độ 100μg/ml (Ivone, 2016). Mẫu có hoạt tính mạnh nhất là cao E-SH (IC50 = 41μg/ml) và cao E-HQ (IC50 = 47μg/ml), mẫu có hoạt tính thấp nhất là cao E-VN (IC50 =
45
82μg/ml). Kết quả trên đã cho thấy mối tương quan giữa tổng hàm lượng phenol trong cao trích và hoạt động kháng oxy hóa của mẫu. Đối với chất đối chứng dương gallic acid (IC50 = 5,62μg/ml), mẫu cao E-SH thể hiện hoạt tính ức chế gốc tự do kém hiệu quả hơn.
Cao trích điều chế từ lồi G.lucidum được đánh giá cao nhất về khả năng bắt gốc tự do DPPH khi so sánh với các loài nấm ăn và nấm dược liệu tại Hàn Quốc (Kim M. Y., 2008). Các lồi nấm Ganoderma khác có giá trị IC50 dao động từ 116 - 243μg/ml (Li W. J., 2012; Lin K. W., 2013). Theo nghiên cứu của Kim (2008), cao trích G.lucidum trung hịa 70% gốc tự do ở nồng độ 9mg/ml. Một nghiên cứu khác về lồi G.lucidum, tại nồng độ 0,64mg/ml trung hịa được 67,6 – 74,4% gốc tự do DPPH (Mau, 2002).
Như vậy, khả năng trung hịa gốc tự do DPPH của cao trích nấm linh chi tuy thấp hơn gallic acid nhưng cao hơn so với các kết quả nghiên cứu khác.
3.2.3. Năng lực khử Fe3+ (Phụ lục 5)
Hoạt động chống oxy hóa có mối tương quan với năng lực khử của các hợp chất có trong cao trích (Negi, 2005). Gordon (1990) đã báo cáo rằng hoạt động chống oxy hóa của các chất khử được thể hiện thông qua sự phá vỡ chuỗi gốc tự do bằng cách cho nguyên tử hydro (Gordon, 1990). Phương pháp xác định khả năng khử Fe3+ là một trong các cơ sở để sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa.
Bảng 3.6. Độ hấp thụ của chất đối chứng dương vitamin C ở nồng độ 0,1mg/ml tại bước sóng 700nm
MẪU Độ hấp thụ tại bước sóng 700nm (OD 700nm) OD trung bình 0,1mg/ml
Vitamin C 1,085 1,089 1,095 1,089±0,002
Bảng 3.7. Kết quả khả năng khử của 5 cao nấm linh chi đỏ (Phụ lục 4) STT MẪU Độ hấp thụ tại bước sóng 700nm (OD 700nm) EC50 STT MẪU Độ hấp thụ tại bước sóng 700nm (OD 700nm) EC50
(mg/ml) 0,1mg/ml 0,5mg/ml 1mg/ml 1 E-VN 0,033±0,003a 0,246±0,003a 0,453±0,015a >1 2 E-HQ 0,233±0,003b 0,500±0,001b 0,957±0,002b 0,46 3 E-NB 0,252±0,031b 0,449±0,027c 0,761±0,036c 0,55 4 E-HC 0,122±0,002c 0,430±0,016c 0,663±0,014d 0,69 5 E-SH 0,175±0,002d 0,673±0,002d 1,189±0,005e 0,37
Các giá trị trong bảng biểu thị trung bình ± độ lệch chuẩn
Các giá trị (a-e) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê giữa các cao chiết trong cùng một nồng độ (P<0,05)
46 0.0 0.5 1.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 Nồng độ mẫu (mg/ml) M ậ t đ ộ q u a n g t ạ i 7 0 0 n m E-VN E-HQ E-NB E-HC E-SH
Hình 3.1. Năng lực khử của các mẫu cao trích ở nồng độ 0,1, 0,5 và 1,0mg/ml. Mỗi giá
trị thể hiện giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3)
Kết quả về năng lực khử của 5 mẫu cao trích G.lucidum được thể hiện thông qua độ hấp thụ quang tại bước sóng 700nm và giá trị EC50 trình bày ở Bảng 3.6 và Hình 3.1.
Từ Hình 3.1 cho thấy các mẫu cao đều thể hiện năng lực khử Fe3+. Năng lực khử của các mẫu cao có thể được giải thích là khả năng cho hydro của các chất chống oxy hóa trong cao trích (Shimada, 1992). Độ hấp thụ của tất cả các mẫu đều có xu hướng tăng theo chiều tăng nồng độ từ 0,1 – 1mg/ml. Do đó, có thể kết luận năng lực khử tỉ lệ thuận theo chiều tăng nồng độ.
Đa số các mẫu cao có giá trị EC50 nhỏ hơn 1mg/ml ngoại trừ mẫu E-VN. Tại nồng độ 1mg/ml, năng lực khử của các mẫu như sau: E-SH (1,198) > E-HQ (0,957) > E-NB
(0,761) > E-HC (0,663) > E-VN (0,453). Tương tự như kết quả ức chế gốc tự do DPPH, mẫu E-SH (EC50 = 0,37mg/ml) và E-HQ (EC50 = 0,46mg/ml) là hai mẫu có hoạt tính mạnh nhất với hàm lượng polyphenol nhiều nhất, hoạt tính thấp nhất là E-VN (EC50 >1mg/ml). Kết quả trên khá tốt khi so sánh với các nghiên cứu gần đây về khả năng khử của G.lucidum với giá trị EC50 dao động từ 0,62 – 0,81mg/ml (Heleno, 2012).
Nghiên cứu cho thấy mẫu cao E-HQ và E-SH có năng lực khử cao hơn so với nghiên cứu khác.
47
3.2.4. Khả năng ức chế enzyme tyrosinase (Phụ lục 6)
Bảng 3.8. Phần trăm ức chế trung bình và giá trị IC50 của chất đối chứng dương gallic acid
Phần trăm ức chế trung bình (Imean %)
IC50 (𝝁g/ml) 5𝝁g/ml 10𝝁g/ml 25𝝁g/ml 50𝝁g/ml 100𝝁g/ml
Kojic
acid 11,82±4,17e 17,58±1,39d 40,91±1,82c 60,91±0,91b 89,09±0,52a 42,80
Các giá trị trong bảng biểu thị trung bình ± độ lệch chuẩn
Các giá trị (a-e) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê giữa các nồng độ (P<0,05)
Bảng 3.9. Phần trăm ức chế enzyme tyrosinase và giá trị IC50 của 5 cao nấm linh chi đỏ (Phụ lục 5) đỏ (Phụ lục 5)
STT MẪU Phần trăm ức chế trung bình (Imean %)
IC50 (𝝁g/ml) 25𝝁g/ml 50𝝁g/ml 100𝝁g/ml 1 E-VN 5,027±0,46a 8,25±0,003a 13,49±0,014a >100 2 E-HQ 8,33±0,72b 25,00±0,001b 52,71±0,002b 94,23