CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Sàng lọc khả năng kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase
3.2.1. Xác định tổng hàm lượng polyphenol (Phụ lục 3)
Bảng 3.3. Tổng hàm lượng polyphenol của 5 loại cao nấm linh chi (Phụ lục 2)
STT Ký hiệu Tên mẫu Tổng hàm lượng polyphenol
(mgGAE/g)
1 E-VN Linh chi Việt Nam 23,25±1,11a
2 E-HQ Linh chi Hàn Quốc 48,29±0,32b
3 E-NB Linh chi Nhật Bản 34,46±0,26c
4 E-HC Linh chi hồng chi 46,35±0,14d
5 E-SH Linh chi sừng hươu 46,76±0,49d
Các giá trị trong bảng biểu thị trung bình ± độ lệch chuẩn
Các giá trị (a-d) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (P<0.05)
Hàm lượng polyphenol được xem là một trong các cơ sở để đánh giá khả năng kháng oxy hóa. Kết quả hàm lượng polyphenol của 5 mẫu cao nấm linh chi đỏ được trình bày ở
Bảng 3.3. Các mẫu cao có sự khác biệt về hàm lượng polyphenol (P<0,05). Tổng hàm lượng
polyphenol của các mẫu dao động từ 23,25mgGAE/g đến 48,29mgGAE/g. Kết quả tương tự trong một nghiên cứu khác đã báo cáo rằng hàm lượng polyphenol của cao G.lucidum được trích bằng ethanol dao động trong khoảng 33,42 – 52,15mgGAE/g (Ćilerdžić, 2014). Qua thử nghiệm, mẫu cao E-HQ (48,29mgGAE/g) có hàm lượng cao nhất và thấp nhất là E-VN (23,25mgGAE/g). Hàm lượng polyphenol của G.lucidum có thể đạt tới 71,43mgGAE/g khi trích ly bằng ethanol (Imtiyaz, 2012). Khi sử dụng các loại dung môi khác như hydroalcoholic, nước nóng để trích ly G.lucidum thì hàm lượng polyphenol lần lượt là 43,14mgGAE/g và 33,00mgGAE/g, hàm lượng thấp hơn so với trích ly bằng ethanol nhưng không đáng kể (Kozarski, 2012).
Trong nghiên cứu khác về khả năng chống oxi hóa của các loài thuộc giống
44
G.applanatum. Trong đó, hàm lượng polyphenol của hai lồi G. lucidum (9,00 mgGAE/gm)
và G.tsugae (9,00 mgGAE.gm-1) là như nhau và cao nhất là G.applanatum (11,6
mgGAE/gm) (Rajoriya, 2015). Tuy nhiên, G.applanatum có giá thành rất cao và có thể lên đến vài chục triệu/kg nên khó có thể ứng dụng rộng rãi.
Bên cạnh đó, Bảng 3.1 và Bảng 3.3 cho thấy được hiệu suất thu hồi của cao nấm
linh chi Hàn Quốc (6,55%) thấp hơn cao hồng chi Đà Lạt (10,5%) và sừng hươu (11,12%) nhưng lại có tổng hàm lượng polyphenol lớn nhất. Do đó, mẫu nấm linh chi Hàn Quốc có thể có khả năng kháng oxy hóa cao nhất.
3.2.2. Xác định hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH (Phụ lục 4)
Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do trình bày trong Bảng 3.4 và Bảng 3.5 thể hiện giá trị phần trăm ức chế và giá trị IC50 của gallic acid và 5 loại cao nấm linh chi đỏ.
Bảng 3.4. Phần trăm ức chế và giá trị IC50 của chất đối chứng dương gallic acid Mẫu Phần trăm ức chế trung bình (Imean %) IC50 Mẫu Phần trăm ức chế trung bình (Imean %) IC50
(𝛍𝐠/𝐦𝐥) 10𝛍𝐠/𝐦𝐥 5𝛍𝐠/𝐦𝐥 2,5𝛍𝐠/𝐦𝐥 1𝛍𝐠/𝐦𝐥
Gallic acid 70,18±1,09a 52,46±0,80b 34,56±1,85c 20,35±0,80d 5,62
Các giá trị trong bảng biểu thị trung bình ± độ lệch chuẩn
Các giá trị (a-d) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê giữa các nồng độ (P<0,05)
Bảng 3.5. Hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH (Phụ lục 3)
STT MẪU Phần trăm ức chế trung bình (Imean %) IC50 (𝛍𝐠/𝐦𝐥) 100𝛍𝐠/𝐦𝐥 50𝛍𝐠/𝐦𝐥 25𝛍𝐠/𝐦𝐥 10𝛍𝐠/𝐦𝐥 1 E-VN 60,82±0,65a 30,85±0,53a 12,33±0,11a 7,40±0,25a 82,48 2 E-HQ 80,88±0,23b 65,08±0,2b 33,53±0,35b 16,87±0,20b 47,49 3 E-NB 75,77±0,44c 50,44±0,00c 29,92±1,00c 13,00±0,67c 57,67 4 E-HC 73,69±0,93d 42,13±0,79d 15,74±0,78d 7,82±0,40a 66,39 5 E-SH 89,59±0,11e 69,07±0,85e 34,88±0,38e 21,20±0,11d 41,42
Các giá trị trong bảng biểu thị trung bình ± độ lệch chuẩn
Các giá trị (a-e) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê giữa các cao chiết trong cùng một nồng độ (P<0,05)
Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do là phương pháp phổ quát trong nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa và là một kỹ thuật nhanh chóng để sàng lọc khả năng ức chế gốc tự do của cao trích (Li, 2012).
Nhìn chung, các mẫu cao đều có hiệu suất trung hòa gốc tự do DPPH tăng dần theo nồng độ và cao nhất tại nồng độ 100μg/ml. Một nghiên cứu về khả năng ức chế gốc tự do của cao ethanol G.lucidum cho ra kết quả tương tự với phần trăm ức chế dao động 65 – 90% tại nồng độ 100μg/ml (Ivone, 2016). Mẫu có hoạt tính mạnh nhất là cao E-SH (IC50 = 41μg/ml) và cao E-HQ (IC50 = 47μg/ml), mẫu có hoạt tính thấp nhất là cao E-VN (IC50 =
45
82μg/ml). Kết quả trên đã cho thấy mối tương quan giữa tổng hàm lượng phenol trong cao trích và hoạt động kháng oxy hóa của mẫu. Đối với chất đối chứng dương gallic acid (IC50 = 5,62μg/ml), mẫu cao E-SH thể hiện hoạt tính ức chế gốc tự do kém hiệu quả hơn.
Cao trích điều chế từ lồi G.lucidum được đánh giá cao nhất về khả năng bắt gốc tự do DPPH khi so sánh với các loài nấm ăn và nấm dược liệu tại Hàn Quốc (Kim M. Y., 2008). Các lồi nấm Ganoderma khác có giá trị IC50 dao động từ 116 - 243μg/ml (Li W. J., 2012; Lin K. W., 2013). Theo nghiên cứu của Kim (2008), cao trích G.lucidum trung hịa 70% gốc tự do ở nồng độ 9mg/ml. Một nghiên cứu khác về loài G.lucidum, tại nồng độ 0,64mg/ml trung hòa được 67,6 – 74,4% gốc tự do DPPH (Mau, 2002).
Như vậy, khả năng trung hịa gốc tự do DPPH của cao trích nấm linh chi tuy thấp hơn gallic acid nhưng cao hơn so với các kết quả nghiên cứu khác.
3.2.3. Năng lực khử Fe3+ (Phụ lục 5)
Hoạt động chống oxy hóa có mối tương quan với năng lực khử của các hợp chất có trong cao trích (Negi, 2005). Gordon (1990) đã báo cáo rằng hoạt động chống oxy hóa của các chất khử được thể hiện thông qua sự phá vỡ chuỗi gốc tự do bằng cách cho nguyên tử hydro (Gordon, 1990). Phương pháp xác định khả năng khử Fe3+ là một trong các cơ sở để sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa.
Bảng 3.6. Độ hấp thụ của chất đối chứng dương vitamin C ở nồng độ 0,1mg/ml tại bước sóng 700nm
MẪU Độ hấp thụ tại bước sóng 700nm (OD 700nm) OD trung bình 0,1mg/ml
Vitamin C 1,085 1,089 1,095 1,089±0,002
Bảng 3.7. Kết quả khả năng khử của 5 cao nấm linh chi đỏ (Phụ lục 4) STT MẪU Độ hấp thụ tại bước sóng 700nm (OD 700nm) EC50 STT MẪU Độ hấp thụ tại bước sóng 700nm (OD 700nm) EC50
(mg/ml) 0,1mg/ml 0,5mg/ml 1mg/ml 1 E-VN 0,033±0,003a 0,246±0,003a 0,453±0,015a >1 2 E-HQ 0,233±0,003b 0,500±0,001b 0,957±0,002b 0,46 3 E-NB 0,252±0,031b 0,449±0,027c 0,761±0,036c 0,55 4 E-HC 0,122±0,002c 0,430±0,016c 0,663±0,014d 0,69 5 E-SH 0,175±0,002d 0,673±0,002d 1,189±0,005e 0,37
Các giá trị trong bảng biểu thị trung bình ± độ lệch chuẩn
Các giá trị (a-e) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê giữa các cao chiết trong cùng một nồng độ (P<0,05)
46 0.0 0.5 1.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 Nồng độ mẫu (mg/ml) M ậ t đ ộ q u a n g t ạ i 7 0 0 n m E-VN E-HQ E-NB E-HC E-SH
Hình 3.1. Năng lực khử của các mẫu cao trích ở nồng độ 0,1, 0,5 và 1,0mg/ml. Mỗi giá
trị thể hiện giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3)
Kết quả về năng lực khử của 5 mẫu cao trích G.lucidum được thể hiện thông qua độ hấp thụ quang tại bước sóng 700nm và giá trị EC50 trình bày ở Bảng 3.6 và Hình 3.1.
Từ Hình 3.1 cho thấy các mẫu cao đều thể hiện năng lực khử Fe3+. Năng lực khử của các mẫu cao có thể được giải thích là khả năng cho hydro của các chất chống oxy hóa trong cao trích (Shimada, 1992). Độ hấp thụ của tất cả các mẫu đều có xu hướng tăng theo chiều tăng nồng độ từ 0,1 – 1mg/ml. Do đó, có thể kết luận năng lực khử tỉ lệ thuận theo chiều tăng nồng độ.
Đa số các mẫu cao có giá trị EC50 nhỏ hơn 1mg/ml ngoại trừ mẫu E-VN. Tại nồng độ 1mg/ml, năng lực khử của các mẫu như sau: E-SH (1,198) > E-HQ (0,957) > E-NB
(0,761) > E-HC (0,663) > E-VN (0,453). Tương tự như kết quả ức chế gốc tự do DPPH, mẫu E-SH (EC50 = 0,37mg/ml) và E-HQ (EC50 = 0,46mg/ml) là hai mẫu có hoạt tính mạnh nhất với hàm lượng polyphenol nhiều nhất, hoạt tính thấp nhất là E-VN (EC50 >1mg/ml). Kết quả trên khá tốt khi so sánh với các nghiên cứu gần đây về khả năng khử của G.lucidum với giá trị EC50 dao động từ 0,62 – 0,81mg/ml (Heleno, 2012).
Nghiên cứu cho thấy mẫu cao E-HQ và E-SH có năng lực khử cao hơn so với nghiên cứu khác.
47
3.2.4. Khả năng ức chế enzyme tyrosinase (Phụ lục 6)
Bảng 3.8. Phần trăm ức chế trung bình và giá trị IC50 của chất đối chứng dương gallic acid
Phần trăm ức chế trung bình (Imean %)
IC50 (𝝁g/ml) 5𝝁g/ml 10𝝁g/ml 25𝝁g/ml 50𝝁g/ml 100𝝁g/ml
Kojic
acid 11,82±4,17e 17,58±1,39d 40,91±1,82c 60,91±0,91b 89,09±0,52a 42,80
Các giá trị trong bảng biểu thị trung bình ± độ lệch chuẩn
Các giá trị (a-e) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê giữa các nồng độ (P<0,05)
Bảng 3.9. Phần trăm ức chế enzyme tyrosinase và giá trị IC50 của 5 cao nấm linh chi đỏ (Phụ lục 5) đỏ (Phụ lục 5)
STT MẪU Phần trăm ức chế trung bình (Imean %)
IC50 (𝝁g/ml) 25𝝁g/ml 50𝝁g/ml 100𝝁g/ml 1 E-VN 5,027±0,46a 8,25±0,003a 13,49±0,014a >100 2 E-HQ 8,33±0,72b 25,00±0,001b 52,71±0,002b 94,23 3 E-NB 2,81±0,22c 6,21±0,027c 16,67±0,036c >100 4 E-HC r 9,68±0,016d 30,65±0,014d >100 5 E-SH 2,21±0,13c 4,83±0,002e 28,24±0,003e >100
Các giá trị trong bảng biểu thị trung bình ± độ lệch chuẩn
Các giá trị (a-e) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê giữa các cao chiết trong cùng một nồng độ (P<0,05)
rkhông thể hiện khả năng ức chế tại nồng độ
Thử nghiệm khả năng ức chế enzyme tyrosinase là cơ sở quan trọng trong việc sàng lọc hoạt tính ức chế sự hình thành melanin của các mẫu và đưa ra hướng ứng dụng thực tiễn. Kết quả thử nghiệm khả năng ức chế PPO thể hiện thông qua phần trăm ức chế trung bình và giá trị IC50 được trình bày ở Bảng 3.9.
Từ kết quả cho thấy phần trăm cứ chế enzyme tyrosinase tăng khi tăng nồng độ. Tại nồng độ 100𝜇g/ml, duy nhất mẫu E-HQ có phần trăm ức chế cao hơn 50%, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các mẫu cao khác (p<0,05). Mặc khác, giá trị IC50 của các mẫu đều lớn hơn 100𝜇g/ml ngoại trừ mẫu E-HQ (IC50 = 94,23𝜇g/ml). Do đó có thể thấy hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của mẫu cao linh chi Hàn quốc là cao nhất. Điều này khá phù hợp khi E-HQ là mẫu có hoạt tính ức chế gốc tự do và khả năng khử cao với hàm lượng polyphenol cao nhất. Nghiên cứu khác về hoạt động ức chế enzyme tyrosinase của G.lucidum
và các loại nấm khác cho thấy giá trị IC50 của G.lucidum đạt 320𝜇g/ml và tại 100 𝜇g/ml chỉ ức chế 40% hoạt động của enzyme tyrosinase (Chien, 2008). Khi trích ly với nước nóng thì giá trị IC50 là 1010𝜇g/ml (H.Ćilerdžić, 2018). Tuy nhiên khi so sánh với chất đối chứng
48
dương gallic acid thì giá trị IC50 của E-HQ gấp 4 lần IC50 của gallic acid (42,80μg/ml), cho thấy hoạt tính ức chế của gallic acid cao hơn E-HQ.
3.2.5. Mối tương quan giữa tổng hàm lượng polyphenol với khả năng ức chế gốc tự do (DPPH), khả nảng khử Fe3+ và khả năng ức chế enzyme tyrosinase (Phụ lục do (DPPH), khả nảng khử Fe3+ và khả năng ức chế enzyme tyrosinase (Phụ lục 7).
Bảng 3.10. Mối tương quan giữa hàm lượng polyphenol với khả năng ức chế gốc tự do, khả năng khử và khả năng ức chế tyrosinase thông qua hệ số tương quan Pearson
Khả năng ức chế gốc tự do (DPPH) (IC50) Khả năng khử với Fe3+ (EC50) Khả năng ức chế enzyme tyrosinase (Phần trăm ức chế) Tổng hàm lượng polyphenol - 0,790 - 0.825 0,791
Hệ số tương quan pearson (r) là một chỉ số thống kê đo lường mối liên hệ tương quan giữa hai biến số và r càng tiến về 1 thì sự tương quan càng mạnh mẽ và chặt chẽ. Nếu r nằm trong khoảng từ 0,50 đến ± 1 thì nó được cho là tương quan mạnh, nằm trong khoảng từ 0,30 đến ± 0,49, thì nó được gọi là tương quan trung bình và nằm dưới ± 0,29, thì nó được gọi là một mối tương quan yếu. Hệ số tương quan giữa các biến số: tổng hàm lượng polyphenol với khả năng ức chế gốc tự do, khả năng khử với Fe3+ và khả năng ức chế enzyme tyrosinase được trình bày ở Bảng 3.10.
Nhìn chung, các biến số đều có mối tương quan với nhau về mặt ý nghĩa thống kê
(P<0,01) và nằm trong khoảng tương quan mạnh. Hệ số tương quan giữa tổng hàm lượng polyphenol với IC50 của khả năng ức chế gốc tự do (DPPH) và với EC50 của khả năng khử với Fe3+ đều mang giá trị âm (-0,790; -0,825). Đồng nghĩa khi hàm lượng polyphenol càng tăng thì giá trị IC50 và EC50 càng giảm (tương quan nghịch biến). Nghiên cứu khác cũng cho thấy mối tương quan nghịch biến giữa hàm lượng polyphenol với IC50 và EC50 (Kozarski M. , 2019). Trên thực tế, các hoạt động kháng oxy hóa của các hợp chất polyphenol đều bắt nguồn từ khả năng ức chế gốc tự do và năng lực khử nên mối tương quan giữ hàm lượng polyphenol với DPPH cũng như là năng lực khử là là mạnh (0,92; 0,96) (M.Lin, 2015). Polyphenol cũng được đề cập đến như là một cơ sở để sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase (Panzella, 2019), chính vì vậy mà tương quan giữa hàm lượng polyphenol và khả năng ức chế enzyme tyrosinase cũng cũng là một mối tương quan mạnh (r =0,791). Nhưng đây là mối tương quan thuận, nghĩa là khi hàm lượng polyphenol tăng thì phần trăm ức chế
49
tyrosinase cũng tăng theo. Tương tự nghiên cứu khác đã báo cáo rằng hàm lượng polyphenol càng cao khả năng ức chế tyrosianase càng tốt (H.K.Choi, 2008). Tóm lại, khả năng ức chế gốc tự do, khả năng khử và khả năng ức chế tyrosinase có mối tương quan chặt chẽ với tổng hàm lượng polyphenol.
3.2.6. Bàn luận và lựa chọn mẫu tối ưu
Thông qua các phương pháp thử nghiệm sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của 5 mẫu cao nấm linh chi đỏ thì ta thấy rằng hai mẫu cao
E-HQ (Linh chi Hàn Quốc) và E-SH (Linh chi sừng hươu) là hai mẫu có hoạt tính kháng
oxy hóa và ức chế enzyme tyrosinase cao nhất. Tuy nhiên, sừng hươu là một loại nấm linh chi đỏ được ni trồng trong điều kiện có ánh sáng, nồng độ O2 và CO2 đặc biệt, thường trung bình trồng 1000 cây thì mới có 1 cây phát triển. Chính vì vậy mà sừng hươu khơng được sử dụng phổ biến trong công nghiệp (Sudheer, 2018). Mẫu E-SH tuy có khả năng kháng oxy hóa mạnh hơn nhưng khả năng ức chế enzyme tyrosinase lại thấp hơn E-HQ. Do đó, mẫu E-HQ được chọn để thử nghiệm trên tế bào.
3.3. Phân tích thành phần hóa học (Phụ lục 8)
Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với đầu dị MS, một số nhóm chất có thể có trong mẫu cao trích từ nấm linh chi Hàn quốc như triterpenoid, polysaccharide, protein, phenolic, alkaloid và flavanoid.
Triterpenoid
Ganoderic acid A (C30H44O7), m/z=517,210
Ganoderic acid B (C30H44O7), m/z=515,297
Ganoderic acid C1 (C30H42O7), m/z=515,209
Ganoderic acid C2 (C30H46O7), m/z=517,280
50 Ganoderic acid D (C30H42O7),
m/z=513,285
Ganoderic acid H (C32H44O9), m/z=571,290
Lucidumol B (C30H50O3), m/z=459,273 Lucidenic acid N (C27H40O6), m/z=461,149
Polysaccharide và protein
𝜷-D-Glucan Adenosine (C10H13N5O4), m/z=268,103
Alkaloid
51
Phenolic và flavanoid
4-hydroxybenzoic acid (C7H6O3), m/z=137,036
p-coumaric acid (C16H15NO3), m/z=270,106
Catechin (C15H14O6), m/z=289,017 Myricetin (C15H10O8), m/z=319,302
Kết quả khảo sát thành phần hóa học cho thấy cao nấm linh chi Hàn quốc chứa các hợp chất hóa học như triterpenoid, polysaccharide, protein, phenolic và alkaloid. Trong đó các hợp chất phenolic và flavanoid được tìm thấy trong mẫu cao chính là các hợp chất tự nhiên được đánh giá cao về khả năng kháng oxy hóa (Ong, 1997). Khơng chỉ vậy, từ các thành phần hóa học đã được phân tích ta thấy rằng ngồi các hợp chất phenolic, mẫu cao E-
HQ còn chứa Ganoderic acid, Lucidenic acid, Lucidumol. Nghiên cứu về khả năng kháng
oxy hóa cũng như ức chế enzyme tyrosinase của nấm linh chi đỏ cũng cho thấy rằng ngoài các hợp chất phenolic thì các hợp chất khác như triterpenoid và polysaccharide cũng góp phần quan trọng trong khả năng kháng oxy hóa (Batra, 2013) (Papp, 2012). Chính vì vậy, nấm linh chi đỏ đặc biệt là nấm Linh chi Hàn Quốc là loài thực vật cần được mở rộng nghiên cứu trên nhiều lĩnh vực để có thể tận dụng khả năng kháng oxy hóa của các hợp chất có trong nấm linh chi.
3.4. Nghiên cứu khả năng ức chế melanin và tyrosinase nội bào 3.4.1. Thử độc tính tế bào (Phụ lục 9) 3.4.1. Thử độc tính tế bào (Phụ lục 9)
52 Control 10 20 40 50 60 80 100 120 0 50 100 150 Nồng độ mẫu (µg/ml) K h ả n ăn g s ố n g c ủ a tế b ào