Thuyết minh quy trình
Mẫu được hịa tan trong dung dịch đệm KH2SO4 – K2HSO4 với pH 6,8, cho 100 L thể tích enzym tyrosinase 300 U ml-1 ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi ủ, cho thêm 1000 L chất nền L-DOPA (1,5 mM) lắc đều đợi lên màu trong 7 phút. Sau đó đem dung dịch đo quang tại bước sóng = 475 nm.
Tổng thể tích của mỗi dung dịch là 3000 μL. Song song với quá trình chuẩn bị dung dịch trên ta cũng chuẩn bị các dung dịch so sánh cho mỗi nồng độ. Các mẫu dung dịch blank sẽ cho enzym mà không cho chất nền, mà được thay thế bằng lượng đệm tương ứng.
Mỗi mẫu ban đầu (chất tinh khiết) được thử ở 4 nồng độ khác nhau: 100; 50; 25; 10 µM. Mỗi nồng độ được tiến hành 3 lần, ứng với mỗi nồng độ ta tính được 3 giá trị phần trăm ức chế (I%). Lấy trung bình 3 giá trị I % từ đó ta sẽ xác định được giá trị phần trăm ức chế ứng với từng nồng độ khảo sát. Nếu hoạt tính của mẫu thử <10 µM sẽ được thử tiếp ở các nồng độ 10, 5, 2,5, 1 µM để tìm ra giá trị IC50.
Lưu ý: Nếu mẫu cao sẽ sử dụng nồng độ µg/ml
Cơ sở để đánh giá khả năng ức chế của những mẫu khảo sát được so sánh với chất đối chứng dương. Trong nghiên cứu này, gallic acid được chọn làm chất đối chứng dương, acid gallic là chất ức chế enzym tyrosinase mạnh.
Đánh giá kết quả bằng phần trăm ức chế được tính như sau: V3 L enzyme V1 L mẫu V2 L đệm pH 6,8 Ủ 30 phút Lắc đều đợi 7 phút V3 L V4 L dd L-DOPA Đo quang ở 475 nm
36
𝐏𝐡ầ𝐧 𝐭𝐫ă𝐦 ứ𝐜 𝐜𝐡ế (%) =𝐀 − 𝐁 𝐀 𝐱𝟏𝟎𝟎
Trong đó:
A – Hoạt tính PPO của mẫu đối chứng B – Hoạt tính PPO trong dịch chiết
Enzyme được sử dụng là: Tyrosinase from mushroom >1000 unit, 9.31 mg solid. 2687 units/mg Solid.
Địa điểm thực hiện: Phịng thí nghiệm trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Tp. Hồ Chí Minh. 2.3.3. Khảo sát thành phần hóa học
Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC)
Trong nghiên cứu này thành phần hóa học của cao ethanol từ nấm Linh chi được xác định bằng HPLC-ESI-MS
Quy trình LC
− Pha tĩnh: cột ACE3- C18 (4,6 ì150mm; 3,5 àm), c n nhit 40C.
Pha động: chương trình pha động được thực hiện theo Bảng 2.2 tại tốc độ dịng 0,5 mL/phút. Trong đó, pha A là dung dịch nước khử ion chứa 0,1% acid formic và pha B là ACN chứa 0,1% acid formic.
− Thể tích mẫu tiêm 20 µl
Bảng 2. 2. Thế tích của pha động và pha tĩnh
Thời gian (phút) %Pha A* % Pha B*
0 95 5
2 95 5
25 0 100
30 0 100
(∗): Tính theo % về thể tích
Đầu dị Mass Spectrometry (MS) với giao diện phun ion (ESI-MS)
Trước khi vào pha động của máy khối phổ, pha động giải ly ra từ cột sắc ký được cho hòa tan vào một hệ mạng chất lỏng (liquid matrix): có thể là nước hoặc nước-hữu cơ, bấy giờ xem như là có dung dịch chất điện ly. Pha động này được cho đi vào ống mao quản làm bằng thép khơng gỉ, đường kính 0,1-0,5 mm và được phun sương ra khỏi ống vi quản với vận tốc phun sương chậm 10-20 µL/phút.
Độ đúng ion m/z được hiệu chỉnh trên dung dịch hiệu chỉnh ESI – L tuning mix bằng bộ bơm mẫu trực tiếp Syringe tại tốc độ 200 μL/giờ
37
Địa điểm thực hiện: Phịng thí nghiệm trung tâm trường Đại học Khoa học tự nhiên Tp. Hồ
Chí Minh.
2.4. Nghiên cứu khả năng ức chế melannin và tyrosinase nội bào 2.4.1. Thử độc tính tế bào 2.4.1. Thử độc tính tế bào
Nguyên tắc
Thử nghiệm MTT là một trong những phương pháp hiệu quả nhất để kiểm tra khả năng sống sót của tế bào. Thử nghiệm này dựa trên sự chuyển đổi MTT (3-(4,5 dimethyl thiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) thành tinh thể formazan thông qua hoạt động của enzyme dehydrogenase trong ty thể (Riss, 2016).