Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme này thuộc nhĩm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhĩm polysaccharide với sự tham gia của nước:
R.R’ + H-OH RH + R’OH
Cĩ 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhĩm: Endoamylase (enzyme nội bào) và exoamylase (enzyme ngoại bào).
Endoamylase gồm cĩ α-amylase và nhĩm enzyme khử nhánh. Nhĩm enzyme khử nhánh này được chia thành 2 loại: Khử trực tiếp là Pullulanase (hay α-dextrin
6-glucosidase); khử gián tiếp là Transglucosylase (hay oligo-1,6-glucosidase) và maylo-1,6-glucosidase. Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide.
Exoamylase gồm cĩ β-amylase và γ-amylase. Đây là những enzyme thủy
phân tinh bột từ đầu khơng khử của chuỗi polysaccharide.
1.3.1. α-amylase
α-amylase cĩ khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên
trong phần tử cơ chất (tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên, khơng theo trật
tự. α-amylase khơng chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nĩ thủy phân cả hạt tinh bột
Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình đa giai đoạn.
+ Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hĩa): chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin ), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hĩa nhanh).
+ Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đường hĩa): các dextrin phân tử thấp tạo thành
bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose khơng cho màu với iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide.
Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành
oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose (vì vậy, người ta cho rằng α-amylase luơn phân cắt amylose thành từng đoạn 6-7 gốc glucopiranose một).
+ Sau đĩ, các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo và bị phân giải chậm đến maltotetrose và maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản
phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α- amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì khơng phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù cĩ chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngồi các đường nĩi trên (72% maltose và 19% glucose) cịn cĩ dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%.
Thơng thường, trong khoảng thời gian ngắn 3060 phút, α-amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp và một ít đường maltose khả
năng dextrin hĩa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nĩ. Vì vậy, người ta
cịn gọi loại amylase này là amylase dextrin hĩa hay amylase dịch hĩa.
α-amylase là một metaloenzyme. Mỗi phân tử α-amylase đều cĩ chứa 130
nguyên tử gam Ca/mol, nhưng khơng ít hơn 16 nguyên tử gam/mol Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme (Modolova, 1965). Do đĩ, Ca cịn cĩ vai trị duy trì sự tồn tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải protein. Nếu phân tử α-amylase bị loại bỏ hết Ca thì nĩ sẽ hoàn tồn bị mất hết khả
này cĩ lẽ liên quan đến hàm lượng Ca trong phân tử và nồng độ Mg2+. Tất cả các
amylase đều bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+. Một số kim
loại như: Li+, Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Sn2+, Cr3+ khơng cĩ ảnh hưởng mấy đến
α-amylase.
Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường khơng
giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm sợi là 4,04,8 (cĩ thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4,55,8). Theo số liệu của Liphis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hĩa và đường hĩa của chế phẩm amylase từ Asp.oryzae trong
vùng 5,66,2. Cịn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hĩa của nĩ là 6,07,0.
Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau. α-amylase của
Asp.oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn Bac.subtilis. Ở pH 3,6 và 0oC, α-amylase của malt bị vơ hoạt hoàn tồn sau 1530 phút; α-amylase vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đĩ hoạt lực của α-amylase của nấm sợi gần như khơng giảm (Fenilxova, Rmoshinoi 1989). Trong dung dịch α- amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH 5,05,5; α-amylase dextrin hĩa của nấm sợi đen cĩ thể chịu được pH từ 2,52,8. Ở 0oC và pH 2,5 nĩ chỉ bị bất hoạt hoàn tồn sau 1 giờ.
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn khác nhau cũng khơng đồng nhất, α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động nhiệt. Nhiệt độ tối thích của nĩ là 500C và bị vơ hoạt ở 70OC (Kozmina, 1991).
Trong dung dịch đệm pH 4,7 α-amylase của Asp.oryzae rất nhạy với tác động của nhiệt độ cao, thậm chí ở 400C trong 3 giờ hoạt lực dextrin hĩa của nĩ chỉ cịn 2229%, hoạt lực đường hĩa cịn 2785%. Ở 500C trong 2 giờ, α-amylase của nấm sợi này bị vơ hoạt hoàn tồn (Miller và cộng sự).
1.3.2. -amylase (1,4--glucan-maltohydrolase)
Xúc tác thủy phân liên kết -1,4-glucoside của tinh bột, glucogen và
polysaccharide cùng loại, phân cắt tuần tự từng gốc maltose một từ đầu khơng khử của mạch.
-amylase khơng cĩ khả năng thủy phân tinh bột sống mà thủy phân mạnh
mẽ hồ tinh bột nên trong cơng nghệ sản xuất bia nĩ chỉ hoạt động ở giai đoạn đường hố do khả năng chịu nhiệt kém.
-amylase phân giải 100% amylose thành maltose, 5458% amylopectin
thành maltose. Qúa trình thủy phân amylopectin được tiến hành từ đầu khơng khử của các nhánh ngoài cùng. Mỗi nhánh ngoài cĩ từ 2026 gốc glucose nên tạo thành
được 1012 phân tử maltose. Khi gặp liên kết -1,4-glucoside đứng kế cận liên kết -1,6-glucoside thì -amylase ngừng tác dụng. Phần saccharide cịn lại là dextrin
phân tử lớn cĩ chứa rất nhiều liên kết -1,6-glucoside và được gọi là -dextrin, - dextrin cho màu tím với iốt. Độ nhớt của dung dịch giảm chậm. Tác dụng của -
amylase lên tinh bột cĩ thể biểu diễn bằng sơ đồ sau:
Nếu cho cả -amylase và -amylase cùng đồng thời tác dụng lên tinh bột thì tinh bột lại bị thủy phân tới 95%.
-amylase là một albumin, tâm xúc tác của nĩ cĩ chứa các nhĩm -SH và nhĩm -COOH cùng với vịng imidazol của gốc histidin.
Khác với -amylase nĩ khơng cần ion Ca2+ làm bền cấu trúc.
-amylase bị ức chế mạnh bởi kim loại nặng như Cu2+, Hg2+, urea, iodoacetamide, iốt, ozon.
-amylase rất dễ bị mất hoạt tính dưới tác dụng của aceton.
Trọng lượng phân tử vi khuẩn 90000, mầm lúa 5500060000.
Maltose ( 5458% ) + -dextrin ( 4246% ) Tinh bột ( glycogen ) -amylase
pH tối thích là 5,15,7 (tối ưu là 5,7) -amylase chịu nhiệt kém, nhiệt độ
thích hợp < 550C, ở 700C -amylase bị vơ hoạt. -amylase cĩ nhiều trong hạt nảy
mầm khơng cĩ trong vi khuẩn và nấm mốc.
1.3.3. Glucoamylase (-1,4 glucan-glucohydrolase)
Glucoamylase xúc tác thủy phân các liên kết -1,4-glucoside và cả liên kết -1,6-glucoside của tinh bột và các polysaccaride khác tương tự.
Sự thủy phân cơ chất dưới tác dụng của glucoamylase tiến hành tuần tự ở từng liên kết một, bắt đầu từ đầu khơng khử của mạch tách dần từng phân tử của glucose. Glucoamylase cũng cĩ khả năng thủy phân maltose, isomaltose, dextrin tới glucose.
Đa số glucoamylase đều thuộc loại enzyme acid thể hiện hoạt lực tối đa ở
vùng pH 3,55,5. Điểm đẳng điện của glucoamylase từ các nguồn khác nhau cũng
khơng đồng nhất: glucoamylase từ A.niger là 6,5 của glucoamylase từ A. awamori
là 7,5; của glucoamylase từ R.delemar là 7,4. pH hoạt động tối thích của
glucoamylase cịn thay đổi tuỳ theo nhiệt độ và thời gian tác dụng. Glucoamylase
của R.delemar cĩ hoạt lực cao nhất ở pH 4,75,0 và nhiệt độ là 55600C, nhưng khi nhiệt độ giảm xuống 400C thì pH tối thích là 4,5. Chế phẩm glucoamylase từ
Endomycopsis cĩ pH tối thích rất hẹp từ 5,45,6 thời gian tác dụng là 30 phút. Nếu
tăng thời gian tác dụng lên thì pH tối mở rộng là 4,75,6.
So với -amylase, glucoamylase bền đối với acid hơn, nhưng lại kém bền
hơn dưới tác dụng của rượu etylic, aceton khơng được bảo vệ bằng Ca2+.
Khơng bị ức chế bởi ion kim loại nặng.
Phân tử lượng của glucoamylase tách từ A.niger 97000 của glucoamylase từ
A. awamori là 62000.
Từ phần tổng quan về Car và enzyme amylase rút ra nhận xét, để thủy phân Car tạo ra Dexcar cĩ khối lượng phân tử 51.00054.000 Da thì loại enzyme
amylase thích hợp là -amylase. Do quá trình thủy phân bởi α-amylase là quá trình
đa giai đoạn nên thời gian thủy phân cĩ ảnh hưởng lớn đến dạng sản phẩm tạo
thành là dextrin phân tử thấp; oligo hay monosaccharide.