CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.2. Phương pháp hóa sinh
a. Xác định hàm lượng chất khô tan (oBx)
Dùng dung dịch nước cất nhỏ lên mặt kính khúc xạ kế rồi đậy nắp kính lại xem nền xanh trở về vị trí khơng chưa, nếu chưa thì dùng tua vít chỉnh cho về khơng.
Dùng ống nhỏ giọt hút dịch quả nhỏ 1–2 giọt vào mặt kính khúc xạ kế, đậy tấm chắn sáng để dịch phủ đều trên lăng kính rồi đưa lên mắt ngắm điều chỉnh độ phóng đại sau cho xem được rõ nhất và đọc số trên thang đo được.
b. Xác định pH [14]
Hiệu chỉnh máy đo bằng dịch chuẩn pH= 4, rửa đầu cực bằng nước cất rồi ngâm ngập đầu cực đo pH trong dung dịch cần đo, đọc giá trị hiển thị ổn định trên máy.
c. Xác định acid tổng [16], [28]
Nghiền nhỏ 3–5 g mẫu trong cối sứ, sau đó chuyển sang tam giác 250 ml, thêm nước cất sao cho đạt thể tích 150 ml. Đun 30 phút cách nhiệt ở nhiệt độ 80–90 0C, thỉnh thoảng lắc. Khi dung dịch đã nguội, lọc qua giấy lọc vào bình định mức 250 ml, thêm nước cất định mức đến vạch, lắc đều dịch.
Lấy 50 ml dịch trên cho vào bình tam giác 250 ml, cho thêm 1–2 giọt phenolphtalein rồi chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho tới khi xuất hiện màu hồng.
Lượng acid hữu cơ hòa tan trong mẫu tính ra %: X = a
Trong đó:
Ngành Cơng nghệ thực Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế
2
Đồ án tốt nghiệp đại học Khóa 2013-
- a: số ml NaOH 0,1N cần để chuẩn độ;
- 0,0067: số gam acid tương ứng với 1ml NaOH 0,1N (0,0067 là hệ số đối với acid malic, nhưng lượng acid tổng số cũng tính theo hệ số này vì acid malic có nhiều trong rau quả);
- T: hệ số điều chỉnh đối với NaOH 0,1N;
- V: tổng thể tích dung dịch chiết ;
- v: số ml dung dịch lấy để chuẩn độ;
- c: khối lượng mẫu (g). d. Độ nhớt [9]
- Chuẩn bị mẫu thử: Mẫu được lắc đều trước khi thí nghiệm. Nếu trong mẫu có các hạt lơ lửng phải lọc qua rây 75 μm để tránh làm nghẽn mao quản nhớt kế.
- Nhớt kế dùng đo phải sấy nóng ở 100 oC trước khi nạp mẫu.
- Nạp 7ml mẫu vào nhánh I của nhớt kế.
- Dùng bóp cao su đẩy cho mực chất lỏng trong mao quản nhánh I lên trên vị trí vạch C khoảng 5 mm. Để chất lỏng chảy tự do và dùng đồng hồ bấm giây xác định thời gian chất lỏng chảy từ vị trí vạch C xuống vị trí vạch E. Ghi khoảng thời gian chảy giữa hai vạch này để tính độ nhớt.
υ = C.t
Trong đó:
- υ: độ nhớt động học, tính bằng cSt hay mm2/s; - C: hằng số của nhớt kế, mm2/s2. (C= 0,035 mm2/s2); - t: thời gian chảy, s.
Ngành Công nghệ thực Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế
2
Đồ án tốt nghiệp đại học Khóa 2013-
Hình 2.6. Nhớt kế.
e. Độ cồn
Sử dụng khúc xạ kế đo độ cồn trong rượu để xác định độ cồn trong dịch lên men. Lấy 20 ml dịch lên men, rót dịch vào bình cầu rồi tráng bình bằng 100 ml nước cất. Nối bình với hệ thống chưng cất cồn, tiến hành chưng cất và thu hồi nước ngưng vào bình định mức 50 ml cho đến khi nước ngưng đến vạch của bình định mức. Dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ nước ngưng sau khi nguội, lấy ra 1–2 giọt chấm vào mặt kính. Đậy nắp kính lại. Quan sát và đọc độ cồn qua ống kính.
2.3.3. Phương pháp đánh giá cảm quan chất lượng sản phẩm
Chất lượng cảm quan sản phẩm được đánh giá theo tiêu chuẩn Việt Nam [15]. Tiêu chuẩn này sử dụng hệ số 20 điểm, xây dựng trên một thang thống nhất có 6 bậc (từ 0–5) và điểm 5 là điểm cao nhất cho một chỉ tiêu.
Đối với sản phẩm đồ uống có cồn nói chung và sản phẩm nước uống lên men nói riêng thì các chỉ tiêu cảm quan quan trọng cần đánh giá gồm: độ trong và màu sắc, mùi, vị.
Dưới đây là bảng chuẩn được xây dựng để tiến hành đánh giá chất lượng cảm quan của sản phẩm nước uống lên men từ trái Sơ ri. Dựa vào bảng để tiến hành lập chọn 5 thành viên hội đồng đánh giá cảm quan.
Khi đánh giá cảm quan các chỉ tiêu cảm quan của sản phẩm, hội đồng cảm quan tham gia cho điểm, kết quả được trình bày là trung bình cộng điểm của các kiểm nghiệm viên. Sau đây là bảng đánh giá về mùi, vị, độ trong và màu sắc lần lượt bảng
Ngành Công nghệ thực Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế
2
Đồ án tốt nghiệp đại học Khóa 2013-
2.2, bảng 2.3 và bảng 2.4.
Bảng 2.2. Đánh giá mùi của nước uống lên men từ trái Sơ ri.
Các chỉ Hệ số
tiêu trọng
lượng
Mùi
Các chỉ tiêu
Vị
Ngành Công nghệ thực Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế
2
Đồ án tốt nghiệp đại học Khóa 2013-
Bảng 2.4. Đánh giá độ trong và màu sắc của nước uống lên men từ trái Sơ ri.
Các chỉ tiêu
Độ trong, màu sắc
2.3.4. Phương pháp thống kê ứng dụng và xử lý số liệu
Số liệu thu nhập được xử lý bằng phương pháp phân tích phương sai ANOVA và kiểm định LSD của phần mềm Statgraphics và vẽ đồ thị tương quan bằng phần mềm Excel.
Phân tích phương sai (Analysis of Variances – ANOVA): Phương pháp này dùng để phân tích sự khác biệt của tính chất giữa các đối tượng hay các nhóm. Khi phân tích chỉ một tính chất của một loạt đối tượng hay một loạt tính chất của một đối tượng ta sử dụng ANOVA. Khi phân tích nhiều tính chất cùng lúc của một đối tượng hay nhiều đối tượng của cùng một tính chất và quan tâm đến sự tác động qua lại giữa các tính chất và đối tượng.
Ngành Công nghệ thực Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế
2
Đồ án tốt nghiệp đại học Khóa 2013-
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đường cong sinh trưởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae [1], [22]
Để xác định được thời điểm lấy giống để bổ sung vào dịch lên men, cần xác định đường cong sinh trưởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae nhằm có được nấm men có sức sống mạnh và số lượng nhiều.
Sự sinh trưởng của nấm men S. cerevisiae được nghiên cứu bằng cách phân tích đường cong sinh trưởng trong mơi trường nuôi cấy Sabouraud. Nấm men được ni cấy trong một bình tam giác với pH mơi trường là 5,6, được cung cấp oxy bằng cách
sử dụng máy lắc ngang, thực hiện ở nhiệt độ phịng thí nghiệm khoảng 28–32 oC. Trong q trình ni cấy khơng thay đổi mơi trường và thời gian ni cấy càng kéo dài thì nồng độ chất dinh dưỡng càng giảm sút, các chất thải của trao đổi chất càng tăng lên. Nếu lấy thời gian ni cấy là trục hồnh và lấy số logarit của số lượng tế bào sống làm trục tung sẽ vẽ được đường cong sinh trưởng của S. cerevisiae sinh sản bằng cách nảy chồi. Đường cong này có 4 giai đoạn (phases) khác nhau như hình 3.1.
300 250 200 bà o 150 S ố tế 100
Hình 3.1. Đồ thị đường cong sinh trưởng của Saccharomyces cerevisiae.
Từ hình 3.1 nhận thấy: Đầu tiên là giai đoạn Tiềm phát (Lag phase) của nấm men bắt đầu từ khi cấy vào mơi trường đến khoảng 12 giờ sau đó đạt 3,4.107 tế bào/ml.
Ngành Cơng nghệ thực Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế
2
Đồ án tốt nghiệp đại học Khóa 2013-
Khi cấy nấm men vào mơi trường mới, nấm men cần thời gian thích nghi, số lượng tế bào thường không tăng lên ngay hay tăng rất chậm. Trong giai đoạn này tế bào chưa phân cắt nhưng thể tích và khối lượng tăng lên rõ rệt do có sự tăng các thành phần mới của tế bào.
Sau giai đoạn tiềm phát là giai đoạn Logarit (Log Phase), khoảng thời gian từ 12 giờ đến 24 giờ với mật độ 3,4.107–2,23.108 tế bào/ml. Trong giai đoạn này nấm men sinh trưởng và phân cắt với nhịp độ tối đa so với bản tính di truyền của chúng nếu gặp mơi trường và điều kiện ni cấy thích hợp. Nhịp độ sinh trưởng của chúng là
không thay đổi trong suốt giai đoạn này, các tế bào phân đôi một cách đều đặn. Do các tế bào sinh ra chỉ khác nhau rất ít cho nên đường cong sinh trưởng là một đường trơn nhẵn chứ không gấp khúc. Quần thể tế bào trong giai đoạn này có trạng thái hóa học và sinh lý học cơ bản là như nhau cho nên việc nuôi cấy ở giai đoạn này thường được sử dụng huấn luyện giống để cấy vào dịch quả tạo sản phẩm.
Tiếp đến là giai đoạn Ổn định (Stationary Phase) hay pha Cân bằng từ 24 giờ đến 48 giờ. Giai đoạn này cho thấy sự sinh trưởng của quần thể dừng lại đạt trạng thái cân bằng, qua hình 3.1 có thể thấy đường cong sinh trưởng đi ngang. Mật độ tế bào nấm men trong giai đoạn ổn định khoảng 2,23.108 –2,70.108 tế bào/ml. Trong giai đoạn này số lượng tế bào sống là khơng thay đổi, có thể do số lượng tế bào mới sinh ra cân bằng với số lượng tế bào chết đi, hoặc là tế bào ngừng phân cắt mà vẫn giữ nguyên hoạt tính trao đổi chất.
Cuối cùng là giai đoạn Tử vong (Death Phase) từ sau 48 giờ. Việc tiêu hao chất dinh dưỡng và việc tích lũy các chất thải độc hại sẽ làm tổn thất đến môi trường sống của nấm men, làm cho số lượng tế bào sống giảm xuống. Số lượng tế bào sinh ra ít hơn số lượng tế bào chết đi, sau 72 giờ số tế bào sống còn lại là 1,27.108 tế bào/ml.
Như vậy, cuối giai đoạn Logarit đến đầu giai đoạn Ổn định (từ 24 giờ đến 30 giờ) thu sinh khối nấm men là thích hợp nhất, vì khi đó quần thể nấm men đạt trạng thái cân bằng, số tế bào sinh ra ở mức cao và tế bào nấm men đang trong thời gian có sức mạnh nhất, cho hiệu suất lên men dịch cao nhất.
3.2. Xác định các chỉ tiêu hóa lý của dịch ép Sơ ri
Ngành Công nghệ thực Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế
2
Đồ án tốt nghiệp đại học Khóa 2013-
Trước khi tiến hành quy trình lên men, dự tính thời gian nghiên cứu là 4 tháng, cần khảo các chỉ tiêu hóa lý ở 3 thời điểm: thời điểm bắt đầu (mẫu 1), thời điểm sau khi bắt đầu 2 tháng (mẫu 2) và thời điểm kết thúc (mẫu 3) quá trình khảo sát, nhằm đảm bảo sự tương đồng về thành phần hóa học của ngun liệu trong suốt q trình tiến hành thí nghiệm. Mỗi mẫu thực hiện xác định các chỉ tiêu được lặp lại 3 lần.
3.2.1. Nồng độ chất khô tan (oBx)
Sơ ri được ép dịch, lọc và đo nồng độ chất khô tan bằng khúc xạ kế đo độ Brix cho kết quả như bảng 3.1.
Bảng 3.1. Nồng độ chất khô tan của dịch ép Sơ ri.
Nồng độ chất
khô tan (0Bx)
(Trong cùng một hàng, những số có số mũ khác nhau thì khác biệt với độ tin cậy 95%)
Từ bảng 3.1 nhận thấy ở 3 mẫu trên sự chênh lệch nồng độ chất khơ tan của trái Sơ ri trong q trình khảo sát khơng đáng kể, nồng độ chênh lệch từ 0,022–0,066 oBx. Như vậy, nguyên liệu trong quá trình khảo sát là có nồng độ chất khơ tan tương đối đồng nhất.
3.2.2. pH
Sau khi thu được dịch ép trái Sơ ri được mang đi đo pH bằng máy đó pH Meter. Sự khác nhau pH giữa các mẫu dịch ép Sơ ri được thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. pH của dịch ép Sơ ri.
pH
(Trong cùng một hàng, những số có số mũ khác nhau thì khác biệt với độ tin cậy 95%)
Từ bảng 3.2 ta thấy 3 mẫu dịch ép Sơ ri trên khơng có sự khác biệt. Chênh lệch giữa số pH lớn nhất và pH thấp nhất là 0,007. Như vậy, nguyên liệu được sử dụng cho những thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố đến q trình lên men có pH chênh lệch trong giới hạn cho phép.
Ngành Công nghệ thực Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế
2
Đồ án tốt nghiệp đại học Khóa 2013-
3.2.3. Acid tổng
Dịch ép trái Sơ ri được xác định hàm lượng acid tổng bằng phương pháp chuẩn độ bằng dung dịch chuẩn NaOH 0,1 N. Sự khác nhau về hàm lượng acid tổng giữa các mẫu dịch ép Sơ ri được thể hiện ở bảng 3.3.
Acid tổng
(Trong cùng một hàng, những số có số mũ khác nhau thì khác biệt với độ tin cậy 95%).
Từ bảng 3.3 ta thấy 3 mẫu dịch ép Sơ ri trên có hàm lượng acid tổng cao nhất là 2,480 và thấp nhất là 2,392, chênh lệch giữa các mẫu khoảng 0,069–0,088 và khơng có sự khác biệt với độ tin cậy 95 %. Như vậy, nguyên liệu trong quá trình khảo sát là có hàm lượng acid tổng tương đối gần nhau.
3.2.4. Độ nhớt
Sau khi thu được dịch ép trái Sơ ri được mang đi đo độ nhớt bằng nhớt kế. Sự khác nhau về độ nhớt giữa các mẫu dịch ép Sơ ri được thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Độ nhớt của dịch Sơ ri.
Độ nhớt
(Trong cùng một hàng, những số có số mũ khác nhau thì khác biệt với độ tin cậy 95%).
Có thể nhận thấy từ bảng 3.4, độ nhớt của dịch ép Sơ ri trong 3 thời điểm với độ tin cậy 95 % khơng có sự khác biệt. Sơ ri trong thời gian khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến q trình tạo thành sản phẩm có độ nhớt tương tự như nhau. Với độ nhớt dao động khoảng từ 1,259–1,283 thì dịch ép Sơ ri khơng cần thiết phải xử lý bằng enzyme pectinase trước khi đưa vào lên men.
3.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất khô tan (oBx) đến chất lượng sản phẩm
Để đánh giá được sự ảnh hưởng của nồng độ chất khô tan đến chất lượng sản
Ngành Công nghệ thực Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế
3
Đồ án tốt nghiệp đại học Khóa 2013-
phẩm nước Sơ ri lên men, đã tiến hành thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của yếu tố trên đến nồng độ chất khơ tan cịn lại, độ cồn và các tính chất cảm quan trong các thời điểm khác nhau của quá trình lên men.
Sơ ri là một loại trái cây có vị hơi chua và chứa lượng chất khô khoảng 8–9 oBx nhỏ hơn so với yêu cầu của dịch lên men vì thế cần bổ sung đường để đạt nồng độ theo yêu cầu của thí nghiệm.
Dịch trái Sơ ri sau khi ép và lọc có pH= 3,7–3,8, cần điều chỉnh pH đạt 4,0 bằng NaHCO3. Khi pH cố định, điều chỉnh nồng độ chất khô tan ở các mức 18 oBx, 20 oBx, 22 oBx, 24 oBx tương ứng mẫu 1, 2, 3, 4. Cấy 2 % tỷ lệ nấm men theo thể tích dung dịch mỗi mẫu là 100 ml với mật độ 2.107 tế bào/ml ở các mức nồng độ chất khô tan để khảo sát các yếu tố bị ảnh hưởng và thu được kết quả ở (bảng 3.5, hình 3.2); bảng 3.6; bảng 3.7.
Bảng 3.5. Sự thay đổi nồng độ chất khô tan trong thời gian lên men.
Thời gian (giờ) 0 24 48 72 96
(Trong cùng một hàng, những số có số mũ khác nhau thì khác biệt với độ tin cậy 95%).
Ngành Công nghệ thực Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế
3
Đồ án tốt nghiệp đại học Khóa 2013-
ta
kh ơ ch ất đ ộ N ồn g
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi nồng độ chất khô tan trong thời gian lên
Từ bảng 3.5 và hình 3.2 cho thấy nồng độ chất khô tan giảm dần theo thời gian lên men, nồng độ chất khơ tan cịn lại sau lên men giảm dần tương ứng với các mức nồng độ chất khô tan được điều chỉnh trước khi lên men. Sau quá trình lên men, nồng độ chất khơ tan cịn sót lại ở mẫu 18 oBx thấp (5,767 oBx), mẫu ở 20 oBx và 22 oBx thì có vị khá hài hịa nồng độ chất khơ tan cịn lại khơng cao (lần lượt là 6,433 oBx và 7,100 oBx) và mẫu 24 oBx có nồng độ chất khơ tan cịn lại khá cao (8,433 oBx).
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ chất khơ tan đến độ cồn sau q trình lên men.
Nồng độ chất khô tan (oBx) 18 20 22 24
Nghiên cứu sự ảnh hưởng của nồng độ chất khô tan đến độ cồn trong quá trình lên men (bảng 3.6) cho thấy, kết thúc quá trình lên men độ cồn tăng dần theo chiều
Ngành Cơng nghệ thực Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế
3
tăng của nồng độ chất khô được điều chỉnh các mẫu. Ở mẫu nồng độ chất khô 18 oBx