II. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ MẪU THỬ
2.Chuẩn bị mẫu thử
- Chuẩn bị môi trường ựường 5%:
+ Dung dịch (1) gồm: đường Rhamnose (Xylose) : 5g Nước cất vô trùng : 100ml
+ Pha dung dịch ựường 5%: 1ml dung dịch (1) + 9ml môi trường OF basal medium
- Chuẩn bị hồng cầu cừu 0,2%:
+ Lấy 0,5 ml hồng cầu cừu ly tâm 3000v/phút, hút bỏ phần nước nổi bên trên, thu lại phần cặn.
+ Lấy phần cặn vừa thu ựược + 1ml NaCl 0,9% hoặc dung dịch PBS , ly tâm 3000v/phút, lấy phần cặn ( tiến hành lặp lại 3 lần giống như trên).
+ Lấy 100ộl cặn + 50 ml nước sinh lý (hoặc dung dịch PBS) thu ựược dung dịch hồng cầu cừu 0,2%
Mẫu (25g)
Môi trường Fraser ơ broth (225ml), ựồng nhất mẫu (30oC, 24h)
0.1ml mẫu ựã xử lý + 10ml Fraser broth, (37oC, 24-48h)
Thạch Oxford (37oC,24-48h) Thạch Palcam (37oC,24-48h) (Chọn 5 khuẩn lạc ựặc trưng trên mỗi loại môi trường)
TSAYE (37oC,24-48h)
Chọn khuẩn lạc ựặc trưng
TSBYE (37oC,24-48h) BHA nghiêng (37oC,24h)
Phản ứng sinh hoá định type - Rhamnose
- Xylose - Manose
- CAMP
- Hemolyse
Sơ ựồ 2.1: Sơ ựồ phương pháp phân lập và giám ựịnh vi khuẩn
Bước 1: Tăng sinh chọn lọc
- Cân 25gam mẫu, thêm 225ml Fraser broth (tỷ lệ 1/10). - đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu, 230 vòng/ phút. - Nuôi ở 30oC/ 24h.
- Hút 0,1ml cho vào ống nghiệm ựã có sẵn 10ml Fraser broth, nuôi ở 37oC, 24 - 48h.
Bước 2: Nuôi cấy trên các môi trường nuôi cấy chọn lọc
- Dùng que cấy 10ộl ria cấy dịch ựã tăng sinh trên hai môi trường thạch PALCAM và Oxford, nuôi cấy ở 37oC, 24 Ờ 48h. Sau ựó lấy ra quan sát hình dạng, tắnh chất mọc.
- Chọn 5 khuẩn lạc (KL) ựiển hình trên PALCAM agar (KL tròn màu xanh lá, hơi lõm hoặc lõm hình cúc áo, môi trường chuyển màu ựen) và 5 KL ựiển hình trên Oxford agar ( KL tròn, gọn, màu xanh lá, lõm hình cúc áo, môi trường chuyển màu ựen). Cấy riêng rẽ trên môi trường TSAYE agar, nuôi ở 37oC/24 Ờ 48h.
- Quan sát hình dạng, tắnh chất mọc của khuẩn lạc trên môi trường TSAYE, chọn khuẩn lạc ựặc trưng (KL tròn, gọn, trắng trong hoặc ựục mờ, soi dưới ánh sáng trắng chếch góc 45o có ánh xanh) cấy trên hai môi trường là:
+ Thạch nghiêng BHA (Brain heart agar) nuôi ở 37oC, 24h. định type. + TSBYE sau 24h ở 37oC ựể thử phản ứng sinh hóa.
Bước 3: Dùng các phản ứng sinh hoá giám ựịnh vi khuẩn L. monocytogenes
- Phản ứng lên men ựường Rhamnose: L. monocytogenes lên men ựường Rhamnose, phản ứng dương tắnh, khi môi trường chuyển từ xanh sang vàng.
- Phản ứng lên men ựường Xylose: L. monocytogenes không có khả (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
năng lên men ựường này, phản ứng âm tắnh, môi trường không ựổi màu, giữ nguyên màu xanh.
giếng. Hồng cầu cừu pha loãng 0,2%: 100ộl vào từng giếng. Hút 100ộl canh khuẩn trên TSBYE cho vào từng giếng tương ứng ựã có hồng cầu cừu pha loãng. Nuôi ở 37oC, 30 phút.
+ Phản ứng dương tắnh: vi khuẩn sử dụng hồng cầu, làm tan hồng cầu cừu, tạo thành một lớp màng mỏng dưới ựáy.
+ Phản ứng âm tắnh: vi khuẩn không sử dụng hồng cầu và tạo thành cục tròn dưới ựáy.
+ Phản ứng CAMP: phản ứng ựược tiến hành trên môi trường thạch máu ựể thử khả năng dung huyết của Listeria monocytogenes.
Ảnh 2.1: Sơ ựồ ựường cấy S. aureus và R. equi trong phản ứng CAMP
+ Dùng hai giống chuẩn Staphylococcus aureus, Rhodococcus equi là
các giống vi khuẩn có khả năng gây dung huyết không hoàn toàn. Trong ựó sử dụng giống S. aureus làm ựối chứng dương (do có khả năng gây dung huyết) cho phản ứng, giống R. equi (không có khả năng gây dung huyết) làm ựối chứng âm.
+ Các giống cần kiểm tra ựược cấy vuông góc với 2 ựường này, vào khoảng giữa hai ựường cấy vi khuẩn này mà không chạm vào ựường cấy của hai giống chuẩn (cách 2 ựường 1- 2 mm). Sau ựó nuôi cấy ở 35oC, 24 Ờ 48h và kiểm tra khả năng gây dung huyết của các chủng.
+ Phản ứng dung huyết xảy ra chắnh là sự cạnh tranh protein của các chủng kiểm tra với giống chuẩn. Với S. aureus và R. equi là hai giống có khả năng gây dung huyết không hoàn toàn. Ta dựa vào vùng cạnh tranh ựể phân biệt các chủng Listeria spp.
o Với chủng L. monocytogenes, L. seeligeri vùng dung huyết gần với
ựường cấy của S. aureus.
o Với chủng L. ivanovii có vùng dung huyết gần với ựường cấy của
R. equi
o Với 3 chủng còn lại không gây dung huyết, không có phản ứng trong kiểm tra này.
o Với L. monocytogenes phản ứng dương tắnh với S. aureus gây dung huyết mạnh và âm tắnh vơi R. equi.
Chú ý: L. seeligeri dung huyết rất yếu và có thể ựọc là không dung
TSAYE
BHA (thạch nghiêng)
định type với kháng huyết thanh O Thạch mềm
O1/2 O5/6 BHI broth
O1.O4 O5.O7.O8.O9
đĩa ựáy bằng (75ộl
nước sinh lý + 75ộl mẫu cấy trong BHI)
đĩa ựáy tròn: 1 mẫu 5 giếng cho 4 loại huyết thanh + ựối chứng (25ộl/giếng)
đọc kết quả Cho thêm 25ộl kháng huyết thanh tương ứng
Sơ ựồ 2.2: Quy trình ựịnh type Listeria monocytogenes bằng kháng huyết thanh Listeria antisera theo tiêu chuẩn ISO 11290
37oC/24h 37oC/24h 30oC hoặc nhiệt ựộ phòng/48h 37oC/24h 50 Ờ 52oC 1h30 phút (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Với các serovar của Listeria monocytogenes ựược xác ựịnh bằng
kháng nguyên H và O. Từ môi trường thạch TSAYE ta chọn những khuẩn lạc ựặc trưng cấy vào môi trường thạch BHA nghiêng, nuôi cấy ở 37oC trong 24h ựể ựịnh type.
Ớ định type với kháng nguyên O:
+ Sử dụng khay thuỷ tinh có các giếng nhỏ. Nhỏ một giọt kháng huyết thanh vào mỗi giếng, sau ựó lấy khuẩn lạc từ TSAYE trộn ựều.
+ Xoay nhẹ khay trong vòng một phút, sau ựó quan sát:
Nếu có kháng nguyên tương ứng thì phản ứng dương tắnh, tức có sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể và ta có thể quan sát ựược bằng mắt thường. Sự kết hợp này xảy ra trong khoảng 2 phút ựược xem là phản ứng dương tắnh.
Ngược lại phản ứng âm tắnh khi không có sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể tương ứng.
Ớ định type với kháng nguyên H:
+ Từ môi trường thạch BHA nghiêng, chọn khuẩn lạc ựặc trưng cấy chắch sâu vào môi trường thạch mềm sau ựó nuôi cấy ở 30oC ở 48h.
+ Từ môi trường thạch mềm tiếp tục nuôi cấy trên trên môi trường BHI broth + Pha loãng canh thang BHI chứa vi khuẩn với nước sinh lý theo tỷ lệ 1:1 (75ộl nước sinh lý : 75ộl mẫu cấy trong BHI/mẫu). Sau ựó tiến hành ựịnh type trên ựĩa 96 giếng. Mỗi mẫu ựược cho vào từng giếng theo sơ ựồ:
đối chứng HA HAB HC HD M1D M1 M1 M1 M1 M2D M2 M2 M2 M2 . . . M96D . . . M96D . . . M96D . . . M96D . . . M96D
- Một mẫu ựược cho vào 5 giếng trong ựó có một giếng ựối chứng (đC) và 4 giếng thắ nghiệm (HA, HAB, HC, HD).
- HA, HAB, HC, HD: là kháng huyết thanh H loại A, AB, C, D
- M1D, M2D, M3D, ..., M96D: mẫu ựối chứng bao gồm 25ộl mẫu vi khuẩn ựã pha loãng mà không chứa kháng huyết thanh.
- M1, M2, M3, M4, ..., M96: mẫu ựịnh type của hỗn dịch bao gồm 25ộl mẫu vi khuẩn ựã pha loãng và 20ộl kháng huyết thanh ựịnh kiểm tra.
Sau ựó, ựể ở nhiệt ựộ 50oC ựến 52oC trong vòng 1h30 phút lấy ra ựọc kết quả. Nếu phản ứng dương tắnh thì có sự tạo thành lớp màng nhăn giống hình cái dù khi quan sát từ dưới ựáy ựĩa lên. Ngược lại, phản ứng âm tắnh không có sự tạo thành lớp màng nhăn có hình dù lộn ngược.
Thu thập mẫu tại trại chăn nuôi lợn
(Qui mô 100 -200 con)
Loại mẫu Nguồn nước
sử dụng Thức ăn Nền chuồng Lau hậu môn Tổng số Số mẫu/trại 1 2 3 4 10 Số trại (5 trại/ tỉnh) 10 10 10 10 40 Tổng số mẫu 10 20 30 40 100
Thu thập mẫu tại lò giết mổ
Loại mẫu Nguồn nước
sử dụng Lau sàn lò mổ Lau thân thịt Manh tràng Tổng số Số mẫu/ ựiểm giết mổ 1 3 8 8 20 Số ựiểm 8 8 8 8 32 Tổng số mẫu 8 24 64 64 160
Thu thập mẫu thịt lợn
Loại mẫu Thịt lợn Tổng số
Tại cửa hàng bán lẻ 60 60
Tại siêu thị 90 90
Tổng số mẫu 150 150
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});