1.2. Nhân giống invitro rong biển
1.2.2.7. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Các CĐHSTTV đóng vai trị quan trọng trong việc kiểm sốt sự sinh trưởng, biệt hóa, phát triển của thực vật nói chung và rong biển nói riêng. Mức độ kiểm sốt phụ thuộc vào lồi, từng giai đoạn ở mỗi nồng độ và loại CĐHSTTV khác nhau. CĐHSTTV như auxin và cytokinin ảnh hưởng đối với quá trình cảm ứng mơ sẹo và biệt hóa phơi.
Auxin có hai nhóm gồm auxin nội sinh (3-Indolebutyric axit (IBA), 3- Indoleacetic axit (IAA)) được tổng hợp từ mô non đang phân chia nhanh và auxin nhân tạo (NAA, 2,4-D…). Auxin kích thích rất mạnh sự phân chia tế bào thượng tầng. Ở mức độ tế bào, auxin kích thích sự trương giãn tế bào, đặc biệt theo chiều ngang làm tế bào lớn lên, kích thích sự tổng hợp các cấu tử cấu trúc lên thành tế bào như các chất cenlulose và pectin… Auxin có vai trị kích thích cảm ứng và tăng trưởng của mơ sẹo. Tuy nhiên, vai trị của auxin lên q trình cảm ứng mơ sẹo và biệt hóa
phơi tùy thuộc vào sự kết hợp giữa các chất và nồng độ. Kết hợp NAA với Benzyl- amino-purine (BAP)hoặc IAA được cho là khơng ảnh hưởng đối với q trình cảm ứng mơ sẹo rong Sụn [48, 49, 88]. Mặt khác, khi kết hợp đúng loại và đúng nồng độ của hai nhóm CĐHSTTV như NAA + Di-methyl-allyl-amino purine (2iP), NAA+ BAP và PAA + 2iP làm tăng kích thước của mơ sẹo [51]. Sử dụng NAA và BA đơn lẻ hoặc kết hợp với nồng độ 0,1 – 1,0 mg.L-1 khơng kích thích cảm ứng mơ sẹo nhưng kích thích biệt hóa phơi vơ tính [48]. Vai trị của auxin đối với q trình phát sinh phơi tùy thuộc vào sự kết hợp giữa các chất và nồng độ [56]. Sự phát triển của phơi vơ tính cây Cà rốt trong ni cấy trải qua một quá trình gồm hai giai đoạn, mỗi giai đoạn cần có mơi trường riêng. Các mơ sẹo được nuôi cấy khởi đầu và nhân sinh khối trên môi trường giàu auxin và thường được sử dụng 2,4-D ở phạm vi nồng độ 0,5 – 1 mg.L-1. Trên mơi trường này, sự phân hố mơ sẹo xảy ra tại các nhóm tế bào phân sinh được gọi là “các cụm phát triển phôi” (EC). Khi cấy chuyền sang môi trường tăng sinh, các EC tiếp tục lớn dần mà không tạo các phôi trưởng thành. Nếu các EC được chuyển sang mơi trường có nồng độ auxin rất thấp (0,01 – 0,1 mg.L-1) hoặc khơng có auxin, chúng sẽ phát triển thành phơi trưởng thành. Sự có mặt của auxin trong môi trường tăng sinh là cần thiết cho mẫu có thể phát triển thành phôi khi chuyển sang môi trường phù hợp. Các mơi trường tăng sinh có thể coi là mơi trường cảm ứng đối với hình thành phơi vơ tính. Những mẫu duy trì liên tục trong mơi trường khơng có auxin sẽ khơng hình thành phơi [89]. Sử dụng NAA đơn hoặc kết hợp với BAP ở nồng độ 0,1 – 1,0 mg.L-1 kích thích biệt hóa phơi vơ tính rong Sụn [48].
Tương tự auxin, cytokinin cũng gồm cytokinin nội sinh (Zeatin, 2-iP (IPA)…) và cytokinin nhân tạo (BAP, Kin, Thidiazuron (TDZ)…). Cytokinin nội sinh được tổng hợp từ rễ và phôi đang tăng trưởng. Cytokinin có vai trị kích thích sự phân chia tế bào. Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt đối với sự hình thành và phân hóa cơ quan thực vật như sự phân hóa chồi, phân chia và phát sinh hình thái tế bào. Cytokinin kích thích sự tăng trưởng tế bào trong điều kiện có auxin. Khi kết hợp PAA và Zeatin ở nồng độ 1 mg.L-1 là đủ cho sự phát triển mô sẹo rong Sụn gai [53]. Khi sử dụng 1 mg.L-1 Kin, 1 mg.L-1 NAA và 0,018 mg.L-1 spermine mơ sẹo hình thành sau 30 ngày ni cấy. Kết hợp 1 mg.L-1 BA với 2,5 mg.L-1 IAA kích thích tạo cụm mơ sẹo dạng sợi ở rong Sụn [49]. Tỉ lệ cảm ứng mô sẹo ở rong Sụn được ni ở mơi trường có bổ sung 1 mg.L-1 NAA và 1 mg.L-1 BAP là 100% khi so sánh với đối chứng [90]. Ở rong Sụn,
tỉ lệ CĐHSTTV là 5 mg.L-1 IAA kết hợp với 1 mg.L-1 BAP [63], 2,5 mg.L-1 BAP kết hợp với 1 mg.L-1 IAA [91] hay IAA và Kin đơn lẻ kích thích phát sinh chồi chính trực tiếp [92].
Ngồi ra, các cytokinin cũng được dùng cho cảm ứng phát sinh hình thái ở các loài thực vật hai lá mầm. Loại cytokinin được sử dụng nhiều trong môi trường nuôi cấy là BAP, nhưng các cytokinin khác như Kin, zeatin và TDZ cũng cho kết quả tốt tuỳ thuộc vào lồi thực vật. Trong ni cấy phơi, nồng độ của các CĐHSTTV là rất quan trọng đối với phản ứng sinh trưởng tối ưu của mẫu cấy. Khi nồng độ quá thấp sẽ khơng kích thích sinh trưởng, ngược lại nồng độ quá cao có thể gây độc cho mẫu… Các mơi trường tăng sinh chứa BAP có thể thúc đẩy sự phân bào nhưng kìm hãm khả năng phát sinh phôi trong trường hợp ở cây Cà rốt. Điều này có lẽ do những kích thích tăng sinh khối chọn lọc ở những thành phần của tế bào không phát sinh phơi. Tuy nhiên hiệu quả tích cực của cytokinin đối với sự hình thành phơi đã được xác nhận trong ni cấy nhiều lồi thực vật. Zeatin có tác dụng kích thích tốt nhất đối với sự hình thành phơi khi được đưa vào mơi trường phơi hố đã chứa mẫu ni cấy được 3 – 4 ngày tuổi [93]. Nhìn chung, vai trị của cytokinin trong phát sinh phơi vơ tính là khác nhau giữa các lồi thực vật phụ thuộc vào kiểu gene, điều kiện môi trường và thời điểm chúng được sử dụng. Đối với rong Sụn khi bổ sung BA đơn hoặc kết hợp với NAA ở nồng độ 0,1 – 1,0 mg.L-1 kích thích phát sinh phơi vơ tính [48]. Từ những vấn đề nêu trên, có thể thấy, CĐHSTTV rất đa dạng và nồng độ sử dụng cũng rất khác nhau. Vì vậy, cần phải nghiên cứu để tìm ra loại và nồng độ thích hợp ứng với mỗi giai đoạn phát triển hình thái của mẫu cấy.