3.2. Nhân giống dòng rong nâu Sacol thuộc loài rong Bắp sú
3.2.2.2. Ảnh hưởng của các loại môi trường dinh dưỡng và NAA,
năng nhân nhanh mô sẹo
Mô sẹo 8 tuần tuổi được cắt nhỏ và đặt vào các môi trường dinh dưỡng khác nhau, có bổ sung 15 g.L-1 agar để làm đông môi trường. Sau 8 tuần nuôi cấy, kết quả nhân nhanh mô sẹo ở môi trường PES tốt hơn so với các mơi trường dinh dưỡng cịn lại (Bảng 3.8 và Hình 3.10).
Khả năng nhân nhanh của cụm mô sẹo ảnh hưởng bởi môi trường dinh dưỡng. Môi trường nuôi cấy MS không phù hợp với sự phát triển của mô sẹo. Mô sẹo bị vỡ ra và hoại tử hồn tồn sau 1 tuần ni. Điều này có thể được giải thích ở mơi trường MS hàm lượng khoáng cao, thẩm thấu vào trong tế bào mô sẹo, tế bào mô sẹo bị vỡ ra, tạo thành cụm màu trắng ngà (Hình 3.10. A). Ở môi trường PES, cụm mô sẹo tiếp tục phát triển, tế bào mới mọc ra từ những đỉnh của tế bào mô sẹo cũ, tạo ra một tổ chức xốp (Hình 3.10. B) và cụm mơ sẹo tăng sinh nhanh. Sau 8 tuần nuôi cấy, mô sẹo đạt trọng lượng 112,00 mg tươi và 11,50 mg khô, cao nhất khi so sánh với các mơi trường cịn lại. Ở mơi trường giảm tồn bộ khống và vi lượng (½ PES) hay giảm ½ vi lượng (PES ½), mơ sẹo vẫn phát triển (Hình 3.10. C); tuy nhiên, sinh khối thu được thấp hơn 90,67 – 91,67 mg tươi, 7,97 – 8,50 mg khô. Môi trường MPI kém hiệu quả khi cụm mơ sẹo có xu hướng rắn lại, chỉ một vài tế bào mơ sẹo tiếp tục phát triển (Hình 3.10. D); sinh khối mô sẹo thu được thấp là 79,00 mg tươi và 6,73 mg khô. Cụm mô sẹo rắn lại, không phân chia khi ni ở mơi trường MPI ½ (Hình 3.10. E), sinh khối mơ sẹo là 65,67 mg tươi và 6,37 mg khô. Ở nghiệm thức không bổ sung dinh dưỡng (đối chứng) cụm mô sẹo cằn cỗi, khơng phát triển, sinh khối giảm cịn 22,67 mg tươi; 1,83 mg khô (Bảng 3.8).
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đối với khả năng nhân nhanh mơ sẹo dịng rong nâu Sacol sau 8 tuần nuôi cấy, n = 30
Môi trường dinh dưỡng
Khối lượng tươi mô sẹo (mg)
Khối lượng khô
mơ sẹo (mg) Mơ tả hình thái
MS Hoại tử Hoại tử Cụm mơ sẹo bở dần và hoại tử hồn
tồn sau 1 tuần ni.
½ MS Hoại tử Hoại tử Cụm mơ sẹo bở dần và hoại tử hồn tồn sau 1 tuần ni.
MS ½ Hoại tử Hoại tử Cụm mô sẹo bở dần và hoại tử hồn tồn sau 1 tuần ni.
PES 112,00a ± 3,00 11,50a ± 0,62
Các tế bào mô sẹo tiếp tục được hình thành tại đầu của mỗi sợi, phân chia nhanh và mô sẹo xốp.
½ PES 90,67b ± 5,51 7,97b ± 0,95
Các tế bào mơ sẹo tiếp tục được hình thành tại đầu của mỗi sợi, phân chia nhanh và mơ sẹo xốp.
PES ½ 91,67b ± 2,52 8,50b ± 0,50
Các tế bào mô sẹo tiếp tục được hình thành tại đầu của mỗi sợi, phân chia nhanh, mô sẹo xốp.
MPI 79,00c ± 1,00 6,73c ± 0,64 Các tế bào mô sẹo tiếp tục phân chia nhưng chậm và mơ sẹo xốp.
½ MPI 65,33d ± 5,03 6,33c ± 0,58 Các tế bào mô sẹo tiếp tục phân chia nhưng chậm, mơ sẹo xốp.
MPI ½ 65,67d ± 4,04 6,37c±0,55 Các tế bào mô sẹo tiếp tục phân chia nhưng chậm và mô sẹo xốp.
Đối chứng 22,67e ± 3,79 1,83d ± 0,29 Các tế bào mô sẹo không phân chia, cụm mô sẹo hoại tử.
Ghi chú: Các chữ cái khác nhau (a, b, c…) trên cùng một cột thể hiện sự khác biệt thống kê với phép thử Ducan (với p < 0,05).
Kết quả nghiên cứu này phù hợp với một số nghiên cứu trên thế giới. Muñoz và cộng sự [90] và Reddy và cộng sự [48] báo cáo rằng tần suất cảm ứng và tăng sinh mô sẹo cao ở môi trường PES trên đối tượng rong Sụn [48, 90]. Môi trường PES cũng được báo cáo cảm ứng thành cơng và gia tăng kích thước mơ sẹo trên một số đối tượng rong biển như: G. chilensis [162, 163], Meristotheca papulosa [156], G.
corticate, Hypnea musciformis và Turbinaria conoides [163]. Sulistiani và cộng sự
[49] cũng tìm thấy mơ sẹo rong Sụn phát triển nhanh hơn ở môi trường PES (35,6%) so với môi trường CW (31,7%) [49]. Tuy nhiên, nghiên cứu của Dawes và Koch [160]
lại chỉ ra rằng, mô sẹo rong Sụn phát triển nhanh và có kích thước lớn ở mơi trường ESS [160]. Sự khác biệt này có thể là do khác nhau nguồn mẫu rong biển ban đầu. Nghiên cứu của George [164] đã cho rằng một số yếu tố có thể ảnh hưởng đến sự phát triển và hình thái của thực vật trong ni cấy in vitro liên quan đến kiểu gen,
tuổi của mẫu ban đầu và mơi trường ni cấy [164]
Hình 3.10. Hình thái cụm mơ sẹo dịng rong nâu Sacol ở các loại môi trường dinh dưỡng khác nhau sau 8 tuần nhân nhanh. Thước: 1mm
A: Mẫu mô sẹo đặc và hoại tử sau 1 tuần cấy chuyển sang mơi trường MS
B: Mẫu mơ sẹo có các tế bào mơ sẹo tiếp tục phân chia khi nuôi ở môi trường PES C: Mẫu mô sẹo tiếp tục phát triển khi ni ở mơi trường PES ½
D: Mẫu mô sẹo rắn lại khi nuôi ở môi trường MPI
E: Mẫu mô sẹo rắn lại, tế bào mô sẹo không phân chia khi ni cấy ở mơi trường MPI ½
Bên cạnh đó, mơ sẹo cũng được cấy vào môi trường PES bổ sung NAA và BAP ở các nồng độ khác nhau. Sau 8 tuần nuôi cấy, kết quả mô sẹo nhân nhanh tốt nhất ở nghiệm thức 1 mg.L-1 NAA + 1 mg.L-1 BAP (Bảng 3.9 và Hình 3.11).
NAA và BAP ảnh hưởng đối với khả năng nhân nhanh khối mô sẹo. Ở nghiệm thức đối chứng (0 mg.L-1 NAA + 0 mg.L-1 BAP) sinh khối mô sẹo thấp nhất, đạt 116,67 mg tươi và 11,43 mg khơ (Bảng 3.9 và Hình 3.11. A). Khi bổ sung 1 – 2 mg.L-1 NAA làm gia tăng khả năng nhân nhanh mơ sẹo (Hình 3.11. B), sau 8 tuần cụm mô sẹo đạt khối lượng (126,00 – 126,33 mg tươi, 12,27 – 13,53 mg khô; tương ứng); cao hơn nghiệm thức bổ sung 1 – 2 mg.L-1 BAP (116,20 – 118,57 mg tươi; 16,27 – 16,87 mg khô; tương ứng). Ở nồng độ 3 mg.L-1 NAA và 3 mg.L-1 BAP thì cụm mơ sẹo phát triển kém, cằn cỗi, có xu hướng già, đạt sinh khối 59,67 – 62,33 mg tươi và 6,03 – 5,60 mg khơ (Bảng 3.9 và Hình 3.11. C). Ngược lại, khi kết hợp NAA và BAP đã gia tăng khả năng nhân nhanh mô sẹo cao hơn so với bổ sung riêng lẻ. Sinh khối mô sẹo cao nhất ở nghiệm thức 1 mg.L-1 NAA + 1 mg.L-1 BAP đạt 215,27 mg tươi và 22,87 mg khô; cụm mô sẹo to, xốp, màu trắng hơi nâu, đây là nguồn vật liệu tốt để thực
hiện những thí nghiệm tiếp theo (Bảng 3.9 và Hình 3.11. D). Tiếp theo ở nồng độ 1 mg.L-1 NAA + 2 mg.L-1 BAP, sinh khối đạt 190,37 mg tươi và 19,20 mg khơ (Hình 3.11. E).
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của NAA và BAP đối với khả năng nhân nhanh mơ sẹo dịng
rong nâu Sacol sau 8 tuần nuôi cấy, n = 30
Ghi chú: Các chữ cái khác nhau (a, b, c…) trên cùng một cột thể hiện sự khác biệt thống kê với phép thử Ducan (với p < 0,05).
Các nghiên cứu về ảnh hưởng của NAA và BAP đối với sự nhân nhanh mô sẹo của các lồi rong biển vẫn cịn hạn chế. Nghiên cứu của Dawes và Koch [51] cho thấy, mô sẹo của rong Sụn đạt sinh khối cao nhất khi nuôi trong môi trường bổ sung 1 mg.L-1 NAA [51]. Muñoz và cộng sự [90] báo cáo rằng mô sẹo rong Sụn được đặt trên mơi trường có 0,1 mg.L-1 NAA, hoặc kết hợp 0,1 mg.L-1 NAA và 0,1 mg.L-1 BAP tăng cường khả năng phân nhánh và tỉ lệ cảm ứng (gấp 2 lần) so với đối chứng (khơng có NAA và BAP) [90]. Sự cảm ứng mô sẹo của rong Sụn gai và rong Sụn phụ thuộc nhiều vào tỉ lệ auxin và cytokinin [51]. Việc nuôi cấy mô sẹo rong Sụn gai trong môi trường bổ sung 10 mg.L-1 NAA dẫn đến bị hoại tử; trong khi tỉ lệ tăng sinh mô sẹo cao nhất được quan sát thấy trong môi trường bổ sung 1 mg.L-1 NAA sau một tháng nuôi cấy [51]. Reddy và cộng sự [48] báo cáo rằng mô sẹo được nuôi cấy trên môi
CĐHSTTV (mg.L-1)
Khối lượng tươi mô sẹo
(mg)
Khối lượng khô mô sẹo
(mg)
Mơ tả hình thái NAA BAP
0 0 116,67f ± 4,93 11,43e±0,51
Cụm mô sẹo xốp, các tế bào mô sẹo xếp thành từng sợi, một số cụm tế bào vô tổ chức, màu nâu hơi đỏ.
1 0 126,33e±4,16 12,27e±1,33 Cụm mô sẹo xốp tiếp tục phân chia. 2 0 126,00e±4,58 13,53e±1,22 Cụm mô sẹo xốp tiếp tục phân chia. 3 0 59,67g±3,06 6,03f±0,06 Cụm mô sẹo kém phát triển, cằn cỗi. 0 1 118,57f±1,82 16,87cd±2,54 Cụm mô sẹo xốp tiếp tục phân chia. 0 2 116,20f±1,08 16,27d±2,81 Cụm mô sẹo xốp tiếp tục phân chia. 0 3 62,33g±4,16 5,60f±0,72 Cụm mô sẹo kém phát triển, cằn cỗi.
1 1 215,27a±4,03 22,87a±1,03 Cụm mô sẹo to, xốp, màu trắng hơi nâu, phát triển nhanh.
1 2 190,37b±3,51 19,20bc±1,06 Mô sẹo phát triển nhanh, xốp, màu trắng ngà.
2 1 179,57c±4,18 22,47a±0,50 Mô sẹo xốp, màu trắng. 2 2 155,30d±5,06 19,60b±1,51 Mô sẹo xốp, màu trắng.
trường bổ sung NAA và BAP ở 0,1 – 1 mg.L-1 có thể tăng cường sự phát triển mơ sẹo của rong Sụn [48]. Trong thí nghiệm này, giai đoạn nhân nhanh mơ sẹo, mơi trường PES có bổ sung đơn hoặc kết hợp NAA và BAP nồng độ 1 – 2 mg.L-1 đều gia tăng sự nhân nhanh của mô sẹo; tuy nhiên, sự chênh lệch này không đáng kể. Nhưng ở nồng độ 1 mg.L-1 NAA kết hợp 1 mg.L-1 BAP thì sinh khối tươi mơ sẹo thu được sau 8 tuần nuôi cấy là (215,27 mg) gấp 2 lần so với đối chứng (116,67 mg). Điều này rất có ý nghĩa trong quá trình nhân giống, giảm thời gian của cả quá trình nhân giống.
Hình 3.11. Hình thái cụm mơ sẹo dịng rong nâu Sacol ở môi trường PES bổ
sung NAA và BAP ở các nồng độ khác nhau sau 8 tuần nhân nhanh.
Thước: 1 mm A: Đối chứng B: 2 mg.L-1 NAA C: 3 mg.L-1 BAP D: 1 mg.L-1 NAA + 1 mg.L-1 BAP E: 1 mg.L-1 NAA + 2 mg.L-1 BAP F: 2 mg.L-1 NAA + 1 mg.L-1 BAP G: 2 mg.L-1 NAA + 2 mg.L-1 BAP
Như vậy, môi trường PES có bổ sung 1 mg.L-1 NAA + 1 mg.L-1 BAP được sử dụng để nhân nhanh mơ sẹo dịng rong nâu Sacol. Sau khi đã nhân nhanh mô sẹo, những cụm mơ sẹo 16 tuần tuổi có kích thước lớn thu được từ các nghiệm thức tốt nhất được sử dụng để cảm ứng phơi vơ tính.
3.2.3. Sự phát sinh phơi vơ tính từ mơ sẹo
3.2.3.1. Ảnh hưởng của độ rắn môi trường nuôi cấy đối với khả năng phát sinh phơi vơ tính
Cụm mơ sẹo dịng rong nâu Sacol 16 tuần tuổi được cấy vào môi trường PES ở các độ rắn môi trường khác nhau. Khả năng phát sinh phôi trên môi trường rắn và trong môi trường lỏng cho kết quả hồn tồn khác nhau. Sau 1 tuần ni cấy, cụm mô sẹo được nuôi ở môi trường lỏng bị vỡ ra, sau đó hoại tử hồn tồn. Ở các độ rắn mơi trường cịn lại, cụm mơ sẹo tiếp tục phát triển, có sự tăng trưởng về kích thước. Sau 8 tuần nuôi cấy, kết quả ở môi trường bán lỏng có khả năng phát sinh phơi vơ tính tốt nhất so với các nghiệm thức cịn lại (Bảng 3.10 và Hình 3.12).
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của độ rắn môi trường nuôi cấy đối với sự phát sinh phơi vơ
tính từ mơ sẹo dịng rong nâu Sacol sau 8 tuần nuôi cấy, n = 30
Môi trường Số phôi /mẫu Khối lượng tươi/mẫu (mg) Khối lượng
khơ/mẫu (mg) Mơ tả hình thái
Rắn 0,00b ± 0,00 82,33b ± 6,43 7,90b ± 0,36 Tế bào mô sẹo tiếp tục phân chia.
Bán lỏng 15,67a ± 5,51 135,67a ± 5,03 14,50a ± 0,50
Sợi mô sẹo phát triển dày đặc, ở mỗi sợi có rất nhiều tế bào chứa sắc tố, bề mặt cụm mô sẹo có màu nâu sau 2 tuần nuôi, xuất hiện phôi.
Lỏng Hoại tử Hoại tử Hoại tử
Cụm mô sẹo vỡ ra, màu trắng và hoại tử hoàn tồn sau 1 tuần ni.
Ghi chú: Các chữ cái khác nhau (a, b, c…) trên cùng một cột thể hiện sự khác biệt thống kê với phép thử Ducan (với p < 0,05).
Độ rắn của mơi trường có ảnh hưởng đối với khả năng phát sinh phôi. Ở môi trường rắn, tế bào mơ sẹo tiếp tục phân chia (Hình 3.12. A), cụm mơ sẹo lớn dần lên, đạt sinh khối 82,33 mg tươi và 7,90 mg khô (Bảng 3.10). Ở môi trường bán lỏng,
khối mơ sẹo phát triển nhanh chóng, những sợi mơ sẹo mang theo rất nhiều tế bào có sắc tố (những vi hạt – pigmented callus) (Hình 3.12. B, C); bên cạnh đó, cịn có xuất hiện phơi (somatic embryos). Sau thời gian nuôi 8 tuần, kết quả thu được 15,67 phôi/mẫu, khối lượng cụm mô là 135,67 mg tươi và 14,50 mg khô (Bảng 3.10). Trong môi trường lỏng, mơ sẹo bị ngập hồn tồn trong nước, sau một thời gian cụm tế bào bị tan ra và hoại tử (Hình 3.12. D).
Hình 3.12. Hình thái giải phẫu mơ sẹo dịng rong nâu Sacol ở các điều kiện ni
khác nhau. Thước 100 µm
A: Môi trường rắn
B, C: Môi trường bán lỏng D: Môi trường lỏng
Khả năng tái sinh phơi vơ tính phụ thuộc vào độ rắn của mơi trường và phụ thuộc vào loài [85]. Kết quả nghiên cứu này tương tự với nghiên cứu của Reddy và cộng sự [48] ở rong Sụn, khi cấy chuyển cụm mô sẹo sang mơi trường đặc mới thì sau 8 tuần cụm mô sẹo tiếp tục phát triển thành những sợi mơ sẹo và có khả năng duy trì sự phát triển được hai năm nếu tiếp tục được chuyển sang môi trường mới [48]. Mô sẹo được nuôi cấy ở mơi trường PES bán lỏng thì nâng cao sự phân chia của tế bào và
kích thích mơ sẹo biệt hóa thành phơi vơ tính ở rong Sụn [48] và rong Sụn gai [88]. Tuy nhiên, một số nghiên cứu lại báo cáo rằng mơ sẹo nâng cao biệt hóa thành phơi vơ tính ở mơi trường rắn [86] hay ở môi trường lỏng tĩnh trên rong G. tenuistipitata,
Solieria filiformis [165] hoặc có sự khuấy trộn của nước ở rong Sụn [50].
Trong nghiên cứu này, mô sẹo biệt hóa thành phơi vơ tính ở mơi trường bán lỏng. Do đó, sử dụng mơi trường bán lỏng (4 g.L-1 agar) để thực hiện thí nghiệm tiếp theo khảo sát cảm ứng phôi.
3.2.3.2. Ảnh hưởng của NAA và BAP đối với khả năng phát sinh phơi vơ tính
Sau khi xác định được độ rắn môi trường phù hợp cho q trình phát sinh phơi vơ tính ở mẫu mơ sẹo dịng rong nâu Sacol là mơi trường PES bán lỏng (4 g.L-1 agar). Tiếp tục sử dụng mơi trường PES bán lỏng có bổ sung NAA, BAP đơn lẻ hoặc kết hợp với các nồng độ khác nhau để phát sinh phơi vơ tính. Kết quả, sau 4 tuần ni cấy trên môi trường PES bán lỏng có bổ sung NAA và BAP với các nồng độ khác nhau, các cụm mô sẹo màu trắng ngà chuyển dần sang màu nâu nhạt. Tiếp tục theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy. Sau 8 tuần nuôi cấy, ở nghiệm thức 1 mg.L-1 NAA + 2 mg.L-1 BAP có số phơi vơ tính, sinh khối cao nhất so với các nghiệm thức còn lại (Bảng 3.11 và Hình 3.13).
Bổ sung NAA và BAP đơn hoặc kết hợp với các nồng độ khác nhau đã ảnh hưởng đối với sự phát sinh phơi vơ tính của mơ sẹo dịng rong nâu Sacol. Từ mẫu mô sẹo ban đầu (Hình 3.13 A) được cấy vào mơi trường PES có hoặc khơng bổ sung NAA và BAP. Sau 8 tuần nuôi kết quả cho thấy, ở môi trường PES không bổ sung NAA và BAP cụm mơ có màu nâu, mơ sẹo có xu hướng tiếp tục phân nhánh để phát triển và khối lượng tươi, khối lượng khô cụm mô lần lượt là 63,33 mg, 5,83 mg, số phơi vơ tính hình thành là 20 phơi/mẫu (Hình 3.13. B). Mơi trường PES có bổ sung 1 mg.L-1 BAP thì cụm mơ tăng sinh khá nhanh, cụm mơ có màu nâu, nhìn bề mặt thấy các sợi mơ sẹo đang phát triển, giải phẫu có chứa phơi vơ tính (Hình 3.13. C). Khối lượng đạt 84,67 mg tươi, 8,13 mg khô và số phôi (61,67 phôi/mẫu) (Bảng 3.11). Tuy nhiên, ở các nghiệm thức nồng độ 1 – 2 mg.L-1 NAA và 2 mg.L-1 BAP có một số mẫu bị hoại tử, cụm tế bào tăng sinh chậm và có màu trắng đục. Khối lượng tươi dao động 69,33 – 85,67 mg và khối lượng khô 6,20 – 7,63 mg, phơi vơ tính khơng hình thành.
Đối với nghiệm thức 3 mg.L-1 NAA và 3 mg.L-1 BAP, mô sẹo kém phát triển, hoại tử, giải phẫu mơ khơng có phơi vơ tính, khối lượng tươi (7,67; 5,67 mg; tương ứng) và khối lượng khơ (0,67; 0,53; tương ứng) (Hình 3.13. D). Ngược lại, bổ sung kết hợp NAA và BAP nồng độ 1 – 2 mg.L-1 đã làm gia tăng sự phát sinh phơi vơ tính hơn so với bổ sung riêng lẻ (Bảng 3.11 và Hình 3. 13. E – I). Khối mô sẹo tăng sinh nhanh, sau 8 tuần nuôi cấy ở nghiệm thức 1 mg.L-1 NAA + 2 mg.L-1 BAP đạt 113,33