2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.3.3.1. Hiện trạng các dịng rong Bắp sú đang được ni trồng ở vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh
Để điều tra và thu thập các dịng của lồi rong Bắp sú đang được nuôi trồng ở vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh, tỉnh Khánh Hòa. Tiến hành đi điều tra, thu thập tất cả các dòng rong thuộc lồi rong Bắp sú tại các khu vực ni trồng ở vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh. Ngồi ra, nghiên cứu sinh (NCS) cịn tiến hành tìm kiếm ở các giàn trồng rong Bắp sú khác trong khu vực. Khảo sát lúc người dân tiến hành nhân giống và thu hoạch rong Bắp sú.
Các dòng rong Bắp sú đã thu thập được ở vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh được phân loại theo phương pháp của Doty [1] thông qua sự khác nhau về các đặc trưng hình thái bên ngồi của rong như: Màu sắc, kích thước của thân rong, nhánh rong, đỉnh nhánh và đặc điểm phân nhánh của cây rong.
2.3.3.2. Đánh giá sinh trưởng, hàm lượng và chất lượng carrageenan của các dịng rong thuộc lồi rong Bắp sú thu thập được ở vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh thuộc lồi rong Bắp sú thu thập được ở vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh
Thí nghiệm này được tiến hành nhằm nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng, hàm lượng và chất lượng carrageenan của các dịng rong thuộc lồi rong Bắp sú thu thập được ở vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh sau gần hai mươi năm di trồng.
Những bụi rong khỏe, không trầy xước, màu sắc tươi sáng của hai dòng rong nâu Sacol và nâu Payaka thuộc loài rong Bắp sú đang được nuôi trồng ở vịnh Vân
Phong và vịnh Cam Ranh được chọn lọc và rửa tại hiện trường nhiều lần. Rong được giữ ẩm bằng vải ướt trong thùng xốp và vận chuyển bằng ơ tơ về phịng thí nghiệm Vật liệu Hữu cơ từ Tài nguyên biển. Sau đó, rong được giữ dưới điều kiện bán tự nhiên trong bể kính có thể tích 100 L chứa 80 L nước biển có sục khí, thay nước và rửa rong hàng ngày trong thời gian 2 – 3 ngày. Những ngày tiếp theo giãn dần khoảng cách thay nước và lưu giữ 2 tuần trước khi bố trí nghí nghiệm.
giữ ẩm bằng vải ướt và vận chuyển bằng ô tô đến địa điểm thí nghiệm ở vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh. Mỗi dịng rong được thí nghiệm với 30 bụi (100 g/bụi). Các bụi rong được buộc vào dây với khoảng cách giữa các bụi rong là 40 cm, cố định vào giàn và đặt xuống biển có độ sâu 50 cm được ni bằng hình thức giàn phao nổi (Vịnh Vân Phong) hoặc sử dụng phương pháp giàn căng cố định (Vịnh Cam Ranh), Khánh Hòa [144]. Đo nhiệt độ (°C), độ mặn (‰), pH và thu mẫu nước (để xác định hàm lượng khoáng) vào lúc 6 giờ và 14 giờ, ngoại trừ CĐAS được tính trung bình ngày ở tuần ni thứ 0, 2, 4, 6, 8, 10 và 12.
2.3.3.3. Tạo nguồn vật liệu
Thử nghiệm các loại môi trường dinh dưỡng đối với sự sinh trưởng của rong
giống trong điều kiện in vitro giai đoạn thuần hóa
Một dịng rong thuộc lồi rong Bắp sú có đặc điểm sinh học tốt nhất được nuôi trồng ở vùng sinh thái phù hợp dựa theo kết quả của thí nghiệm trên được chọn để làm thí nghiệm. Rong khỏe màu nâu tươi sáng, có nhiều nhánh thứ cấp, đã được giữ 2 tuần trong điều kiện bán tự nhiên theo mơ tả ở trên. Sau đó, dùng dao mổ cắt thành những mẫu có kích thước khoảng 5 cm, khối lượng khoảng 1,2 g. Các mẫu rong này được nuôi dưới điều kiện in vitro trong bình thủy tinh 500 mL có chứa 400 mL các loại mơi trường dinh dưỡng như: PES; PES ½; ½ PES (Phụ lục 1.4.2) [77]; MPI; MPI ½; ½ MPI (Phụ lục 1.4.3) [78]; MS; MS ½ và ½ MS (Phụ lục 1.4.1) [79] và đối chứng (không bổ sung dinh dưỡng) nhằm xác định loại mơi trường thích hợp trong giai đoạn ni thuần hóa rong giống. Mơi trường ni trồng là các mơi trường dinh dưỡng được pha bằng nước biển có độ mặn 30 – 35‰ đã được lọc qua lưới có kích thước lỗ 22 µm. Mơi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở 121oC với thời gian 20 phút. Các bình thủy tinh có lắp sục khí. Thay nước sau mỗi 1 tuần đồng thời bổ sung dinh dưỡng. Thí nghiệm được bố trí với mỗi nghiệm thức là 3 bình thủy tinh chứa 10 nhánh rong/bình.
Khử trùng mẫu in vitro
Thu nhận và tiền xử lý mẫu: Những nhánh rong khỏe có màu sắc tươi sáng, có nhiều nhánh thứ cấp đã được thuần hóa trong phịng thí nghiệm 4 tuần, sử dụng dao mổ cắt thành những đoạn dài khoảng 5 cm. Sau đó, những đoạn rong này được khử
trùng thô trên bề mặt theo phương pháp của Reddy và cộng sự [48]. Các mẫu cấy được chuyển vào bình tam giác (có thể tích 250 mL) đậy kín bằng nút cao su và đưa vào tủ cấy vô trùng.
Thao tác khử trùng mẫu cấy: Rong đã được khử trùng thô bằng dung dịch nước tẩy rửa theo mô tả như trên. Trong tủ cấy, mẫu được rửa với nước biển vô trùng 4 – 5 lần, mỗi lần 5 phút. Tiếp đó, mẫu được khử trùng bằng nano bạc (Phụ lục 1.2) có bổ sung vài giọt Tween-80 hoặc kháng sinh (Phụ lục 1.2) với nồng độ, thời gian khác nhau tùy từng chất khử trùng và đối chứng (Natri hypochlorite) (Bảng 2.1). Cuối cùng, mẫu được rửa lại 4 – 5 lần bằng nước biển vô trùng trước khi cấy mẫu vào môi trường. Mục đích của thí nghiệm này là đánh giá hiệu quả của loại chất khử trùng và thời gian xử lý mẫu đối với tỉ lệ nhiễm VSV, tỉ lệ mẫu sống và sạch VSV.
Bảng 2.1. Nồng độ, thời gian khử trùng bằng nano bạc và kháng sinh
Chất khử trùng Thời gian Nồng độ (%) Nano bạc 5 phút 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,10 10 phút 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,10 20 phút 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,10 30 phút 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,10 Kháng sinh 24 giờ 1; 2; 3; 4 Natri hypochlorite 15 phút 1
Sau khi khử trùng, tiến hành cắt nhỏ mẫu vơ trùng với kích thước 4 – 5 mm rồi đặt vào bình có chứa 20 mL mơi trường PES (bổ sung 15 g.L-1 agar để làm đông môi trường) theo phương pháp của Reddy và cộng sự [48]. Những lọ chứa mẫu được đặt dưới điều kiện in vitro. Môi trường nuôi cấy là môi trường PES được pha bằng nước biển có độ mặn 30 – 35‰ đã được lọc qua lưới có kích thước lỗ 22 µm và bổ sung 15 g.L-1 agar (Algae culture agar, Himedia, Ấn Độ). Môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở 121oC với thời gian 20 phút. Thí nghiệm được bố trí với mỗi nghiệm thức được cấy 30 bình, mỗi bình 1 mẫu.
2.3.3.4. Cảm ứng mơ sẹo và nhân nhanh mô sẹo
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố nuôi cấy đến sự cảm ứng mô sẹo
Sử dụng mẫu đã được khử trùng bằng loại, nồng độ và thời gian khử trùng tối ưu ở thí nghiệm trên để làm nguyên liệu cho các thí nghiệm cảm ứng mơ sẹo. Cắt nhỏ
mẫu vơ trùng với kích thước 4 – 5 mm rồi đặt vào đĩa petri có chứa 40 mL mơi trường. Đĩa petri mang mẫu cấy được bọc kín bằng Parafilm nhằm tránh khơng khí bên ngồi lọt vào và đặt dưới điều kiện in vitro. Các yếu tố nuôi cấy được khảo sát là: (1) các loại mơi trường dinh dưỡng: PES; PES ½; ½ PES (Phụ lục 1.4.2) [77]; MPI; MPI ½; ½ MPI (Phụ lục 1.4.3) [78]; MS; MS ½ và ½ MS (Phụ lục 1.4.1) [79] và đối chứng (không bổ sung dinh dưỡng); (2) CĐHSTTV: Đơn lẻ hoặc kết hợp NAA (0,1; 1,0 mg.L-1) hoặc BAP (0,1; 1,0 mg.L-1) và đối chứng (không bổ sung NAA và BAP); (3) hàm lượng agar (Algae culture agar, Himedia, Ấn Độ): 5; 10; 15; 20 g.L-1; (4) CĐAS: 0; 5; 15; 35; 55 µmol photons.m-2.s-1 dưới ánh sáng trắng đèn huỳnh quang với số lượng đèn khác nhau để tìm ra điều kiện cảm ứng mơ sẹo. Mơi trường nuôi cấy là các môi trường dinh dưỡng được pha bằng nước biển có độ mặn 30 – 35‰ đã được lọc qua lưới có kích thước lỗ 22 µm và bổ sung 15 g.L-1 agar (Algae culture agar, Himedia, Ấn Độ). Tùy vào mục đích từng thí nghiệm mà có sự điều chỉnh hàm lượng agar, mơi trường dinh dưỡng và các CĐHSTTV phù hợp.Môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở 121oC với thời gian 20 phút. Các thí nghiệm được tiến hành độc lập, mỗi thí nghiệm bố trí với mỗi nghiệm thức gồm 3 đĩa petri, mỗi đĩa petri chứa 10 mẫu.
Ảnh hưởng của các loại môi trường dinh dưỡng, NAA và BAP đối với khả năng
nhân nhanh mô sẹo
Cụm mô sẹo 8 tuần tuổi thu từ thí nghiệm trên được cắt thành những mẫu có kích thước khoảng (5 x 5 mm) và khối lượng 30 mg được đặt vào đĩa petri có chứa 40 mL mơi trường. Đĩa petri mang mẫu cấy được bọc kín bằng Parafilm nhằm tránh khơng khí bên ngồi lọt vào và đặt dưới điều kiện in vitro. Các yếu tố nuôi cấy được khảo sát là: (1) các loại môi trường dinh dưỡng: PES; PES ½; ½ PES (Phụ lục 1.4.2) [77]; MPI; MPI ½; ½ MPI (Phụ lục 1.4.3) [78]; MS; MS ½ và ½ MS (Phụ lục 1.4.1) [79] và đối chứng (không bổ sung dinh dưỡng); (2) CĐHSTTV: Đơn lẻ hoặc kết hợp NAA (1; 2; 3 mg.L-1) hoặc BAP (1; 2; 3 mg.L-1) và đối chứng (không bổ sung NAA hoặc BAP) nhằm xác định được môi trường phù hợp trong giai đoạn nhân nhanh mô sẹo rong Bắp sú. Môi trường nuôi cấy là các môi trường dinh dưỡng được pha bằng nước biển có độ mặn 30 – 35‰ đã được lọc qua lưới có kích thước lỗ 22 µm và bổ sung 15 g.L-1 agar (Algae culture agar, Himedia, Ấn Độ). Tùy vào mục đích từng thí nghiệm mà có sự điều chỉnh mơi trường dinh dưỡng và các CĐHSTTV phù hợp. Môi
trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở 121oC với thời gian 20 phút. Các thí nghiệm được tiến hành độc lập, mỗi thí nghiệm được bố trí với mỗi nghiệm thức gồm 3 đĩa petri, mỗi đĩa petri chứa 10 mẫu.
2.3.3.5. Sự phát sinh phơi vơ tính từ mơ sẹo
Cụm mô sẹo 16 tuần tuổi của rong Bắp sú được lấy từ kết quả của thí nghiệm nhân nhanh mơ sẹo có kích thước khoảng 2 x 2 mm và khối lượng khoảng 10 mg sau đó được đặt vào đĩa petri có chứa 40 mL mơi trường PES đặc (15 g.L-1 agar); hoặc môi trường PES bán lỏng (4 g.L-1 agar); hoặc môi trường PES lỏng nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của độ rắn môi trường đối với khả năng phát sinh phơi vơ tính từ mơ sẹo rong Bắp sú. Sau đó, sử dụng trạng thái vật lí môi trường tối ưu ở trên, bổ sung đơn lẻ hoặc kết hợp NAA (1; 2; 3 mg.L-1) hoặc BAP (1; 2; 3 mg.L-1) và đối chứng (không bổ sung NAA hoặc BAP) nhằm xác định được loại và nồng độ CĐHSTTV phù hợp đối với khả năng phát sinh phơi vơ tính từ mơ sẹo rong Bắp sú.
Mơi trường nuôi cấy là các môi trường dinh dưỡng được pha bằng nước biển có độ mặn 30 – 35‰ đã được lọc qua lưới có kích thước lỗ 22 µm. Tùy vào mục đích từng thí nghiệm mà có sự điều chỉnh hàm lượng agar và các CĐHSTTV phù hợp. Môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở 121oC với thời gian 20 phút. Đối với nghiệm thức môi trường PES đặc và PES bán lỏng, mỗi nghiệm thức được cấy 3 đĩa petri, mỗi đĩa petri chứa 10 mẫu. Ở nghiệm thức môi trường PES lỏng được cấy vào 30 bình cầu đáy bằng 100 mL có chứa 40 mL mơi trường, mỗi bình cầu chứa 1 mẫu. Các đĩa petri và bình cầu đáy bằng chứa mẫu cấy được đặt dưới điều kiện in vitro.
2.3.3.6. Khả năng tái sinh cây con và thích nghi điều kiện sống tự nhiên
Ảnh hưởng của một số yếu tố đối với khả năng tái sinh cây con từ phơi vơ tính
Những mẫu có chứa các phơi vơ tính rong Bắp sú được ni cấy trong bình cầu đáy bằng 250 mL có chứa 200 mL mơi trường PES lỏng và được lắc 100 vòng/phút trong thời gian 2 tuần. Sau khi các phôi rời nhau, tiến hành lọc và chọn những phơi đồng đều nhau có kích thước 0,5 – 0,6 mm, có đặc tính khỏe để làm các thí nghiệm tái sinh cây con. Các yếu tố nuôi cấy được khảo sát là: (1) các loại môi trường dinh dưỡng: PES; PES ½; ½ PES (Phụ lục 1.4.2) [77]; MPI; MPI ½; ½ MPI (Phụ lục 1.4.3) [78]; MS; MS ½ và ½ MS (Phụ lục 1.4.1) [79] và đối chứng (không
bổ sung dinh dưỡng); (2) sự xáo trộn của nước: Lắp hệ thống sục khí, hoặc đặt lên máy lắc có tốc độ lắc lần lượt là 50 vòng/phút và 100 vòng/phút; (3) CĐAS: 0; 15; 35; 55; 75 µmol photons.m-2.s-1 dưới ánh sáng trắng đèn huỳnh quang; (4) độ mặn: 20; 25; 30; 35; 40‰; (5) nhiệt độ: 20; 25; 27; 30; 35°C được kiểm tra để tìm ra điều kiện tái sinh cây con tốt nhất. Môi trường nuôi trồng là các môi trường dinh dưỡng được pha bằng nước biển đã được lọc qua lưới có kích thước lỗ 22 µm. Tùy vào mục đích từng thí nghiệm mà có sự điều chỉnh độ mặn và môi trường dinh dưỡng.Môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở 121oC với thời gian 20 phút. Các thí nghiệm được tiến hành độc lập, mỗi thí nghiệm được bố trí với mỗi nghiệm thức ba bình cầu đáy bằng có thể tích 250 mL chứa 200 mL mơi trường, mỗi bình cầu chứa 10 phơi.
Giai đoạn thích nghi ngồi tự nhiên của cây con có nguồn gốc in vitro
Giai đoạn cuối cùng của nhân giống in vitro là chuyển cây con ra ngoài điều kiện ni trồng tự nhiên. Tỉ lệ sống sót của cây khi chuyển ra điều kiện ex vitro được quyết định bởi nhiều yếu tố như tình trạng sinh lý của cây, kích thước cây con và các yếu tố môi trường như nguồn ánh sáng. Trong các yếu tố đó, kích thước cây con và nguồn ánh sáng đóng vai trị rất quan trọng quyết định tỉ lệ sống sót của cây ở giai đoạn thích nghi để cây con quen với điều kiện tự nhiên. Kích thước cây con phù hợp để đưa ra ngồi ni trồng ở điều kiện tự nhiên giúp tăng tỉ lệ sống sót và giảm chi phí sản xuất. Bên cạnh đó, thiết lập một hệ thống cung cấp ánh sáng phù hợp cho từng loại cây con in vitro để cây thích nghi với điều kiện ánh sáng tự nhiên trước khi chuyển ra điều kiện ex vitro đảm bảo cho cây quang hợp và sinh trưởng tốt.
Cây con 8 tuần tuổi có nguồn gốc in vitro, kích thước khoảng 2,5 cm, khối
lượng khoảng 1 g và 5 – 8 nhánh được cố định vào mảnh vụn san hơ hoặc đá, đặt trong bể kính có thể tích 100 L, kích thước 25 x 35 x 50 cm, sục khí liên tục, có hệ thống điều nhiệt để đạt được nhiệt độ 25 – 27°C và đặt dưới các nguồn ánh sáng khác nhau (Bảng 2.2) nhằm khảo sát ảnh hưởng của nguồn ánh sáng đối với khả năng sinh trưởng cây con có nguồn gốc in vitro ở giai đoạn thích nghi bán tự nhiên. CĐAS của các nguồn ánh sáng khác nhau được xác định vào 12 giờ trưa và được đo tại đáy bể. Chu kì chiếu sáng 10 giờ/ngày đối với các nghiệm thức sử dụng hệ thống chiếu sáng. Theo dõi sự phát triển của rong và màu nước hàng ngày. Môi trường nuôi trồng là môi trường PES được pha bằng nước biển có độ mặn 30 – 35‰ đã được lọc qua lưới
có kích thước lỗ 22 µm. Thay nước và bổ sung môi trường dinh dưỡng 1 tuần/lần. Thí nghiệm được bố trí với mỗi nghiệm thức 3 bể kính, mỗi bể kính chứa 10 cây.
Bảng 2.2. Các thông số nguồn ánh sáng khác nhau
Nguồn ánh sáng Đặc điểm CĐAS (µmol photons.m-2.s-1) 1 Ánh sáng trắng đèn huỳnh quang 55 2 Ánh sáng trắng đèn huỳnh quang 75 3 Đèn led 150
4 Ánh sáng tự nhiên có giảm ½ CĐAS bằng mái che
(mái tôn trong và lưới màu xanh đen) 250
5 Ánh sáng tự nhiên 500
Cùng với nguồn ánh sáng, loại cây con cũng được kiểm tra. Cây con 8 tuần tuổi có nguồn gốc in vitro với các kích thước, số nhánh và khối lượng khác nhau được chuyển ra nuôi trồng ex vitro nhằm khảo sát ảnh hưởng của loại cây con có nguồn gốc in vitro đối với khả năng sinh trưởng ở giai đoạn thích nghi bán tự nhiên. Tiến hành theo dõi sáu loại cây con in vitro (Bảng 2.3).
Bảng 2.3. Các chỉ tiêu sinh trưởng của cây con in vitro trước khi thí nghiệm
Loại cây Số nhánh (nhánh/cây) Kích thước (cm) Khối lượng (g)
1 3,00 ± 1,00 0,52 ± 0,06 0,36 ± 0,08 2 4,33 ± 1,15 1,0 ± 0,09 0,53 ± 0,06 3 4,67 ± 0,58 1,49 ± 0,10 0,63 ± 0,12 4 6,00 ± 1,00 2,06 ± 0,16 0,86 ± 0,05 5 6,33 ± 0,58 2,52 ± 0,10 0,96 ± 0,05 6 6,67 ± 0,58 3,01 ± 0,12 1,23 ± 0,06
Rong được cố định vào mảnh vụn san hơ hoặc đá, đặt trong bể kính có thể tích 100 L, kích thước 25 x 35 x 50 cm, sục khí liên tục, có hệ thống điều nhiệt để đạt được nhiệt độ 25 – 27°C và được đặt dưới nguồn ánh sáng tối ưu ở thí nghiệm trên.