2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1.2. Điều kiện ex vitro
Điều kiện bán tự nhiên (phịng thí nghiệm Vật liệu Hữu cơ từ Tài nguyên biển, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang): Sử dụng máy điều nhiệt để đạt được nhiệt độ trong bể kính là 27 ± 2oC, che bóng râm bằng tơn trong và lưới xanh đen để giảm một nửa CĐAS tự nhiên.
Trong thời gian ni trồng thích nghi rong có nguồn gốc in vitro ở vịnh Vân Phong, các yếu tố môi trường như sau: Nhiệt độ (26 – 28oC), pH (8,04 – 8,2) và CĐAS (257 – 525 µmol photons.m-2.s-1).
2.3.2. Ni trồng và chăm sóc rong Bắp sú ngồi tự nhiên
Kỹ thuật ni trồng và chăm sóc rong Bắp sú ngồi tự nhiên bao gồm các bước chính như sau:
Chọn vùng trồng: Trong kỹ thuật trồng Kappaphycus, việc lựa chọn vùng trồng có ý nghĩa rất quan trọng trong việc quyết định đến năng suất, chi phí sản xuất, tính ổn định và hiệu quả kinh tế. Rong Bắp sú có thể trồng ở các loại thủy vực khác nhau ven biển ở độ sâu từ 0,5 m đến 10 m. Tùy thuộc vào điều kiện tự nhiên nơi trồng mà đưa ra các phương pháp trồng cho thích hợp. Rong được ni trồng bằng hình thức giàn phao nổi (vịnh Vân Phong) và phương pháp giàn căng cố định (vịnh Cam Ranh). Chuẩn bị giống: Chọn cây rong khỏe mạnh, khơng q già, có màu sắc tươi sáng, khơng bị đứt gãy hay có dấu hiệu bị thương tổn bề mặt thân rong, có rất nhiều nhánh nhỏ và đỉnh nhánh còn nguyên.
Kĩ thuật làm giàn: Đối với phương pháp giàn phao nổi, giàn phao được giữ bằng cách buộc dây chính vào rạn san hơ chết hoặc đá lớn dưới đáy. Bằng hình thức này, người trồng rong phải tốn thêm chi phí thuê lao động lặn chuyên nghiệp cho việc tạo giàn trồng. Đối với phương pháp giàn căng cố định, giàn phao được cố định bằng cách sử dụng cọc cây xung quanh. Do địa hình nền đáy cát sỏi có lẫn ít bùn nên khơng thể cố định giàn căng bằng neo hay bao cát do chi phí cho neo quá lớn. Sử dụng lưới rào chắn xung quanh để tránh các loài cá vào ăn rong, gây ảnh hưởng lớn đến sự phát triển bình thường của rong và năng suất trồng.
Kĩ thuật chăm sóc: Thường xuyên theo dõi sự phát triển của rong 2 – 3 ngày/lần. Người chăm sóc phải gỡ bỏ rong tạp, các lồi động vật có vỏ (hàu, ốc), bọt biển hoặc bất kỳ vật liệu trôi dạt mắc kẹt vào rong và giàn rong. Rong được vệ sinh thường xuyên để loại bỏ các chất lơ lửng bám vào. Bên cạnh đó, những cây rong yếu (bị bệnh trắng nhũn thân, bệnh do phụ sinh) cũng được loại bỏ và thay thế bằng bụi rong khác. Cơng việc chăm sóc này địi hỏi tính cẩn thận và chun cần tránh làm rong bị gãy hay dập thân, gây ảnh hưởng đến sự phát triển bình thường của rong. Khi
rong sinh trưởng làm tăng trọng lượng cho giàn trồng, giàn nuôi rong được bổ sung thêm phao gắn vào các góc và dây để đề phịng chìm q sâu trong nước. Cuối cùng, thường xuyên kiểm tra, sửa chữa neo và dây trong khu vực thí nghiệm.
2.3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.3.3.1. Hiện trạng các dịng rong Bắp sú đang được ni trồng ở vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh
Để điều tra và thu thập các dịng của lồi rong Bắp sú đang được nuôi trồng ở vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh, tỉnh Khánh Hòa. Tiến hành đi điều tra, thu thập tất cả các dòng rong thuộc lồi rong Bắp sú tại các khu vực ni trồng ở vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh. Ngồi ra, nghiên cứu sinh (NCS) cịn tiến hành tìm kiếm ở các giàn trồng rong Bắp sú khác trong khu vực. Khảo sát lúc người dân tiến hành nhân giống và thu hoạch rong Bắp sú.
Các dòng rong Bắp sú đã thu thập được ở vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh được phân loại theo phương pháp của Doty [1] thông qua sự khác nhau về các đặc trưng hình thái bên ngồi của rong như: Màu sắc, kích thước của thân rong, nhánh rong, đỉnh nhánh và đặc điểm phân nhánh của cây rong.
2.3.3.2. Đánh giá sinh trưởng, hàm lượng và chất lượng carrageenan của các dịng rong thuộc lồi rong Bắp sú thu thập được ở vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh thuộc lồi rong Bắp sú thu thập được ở vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh
Thí nghiệm này được tiến hành nhằm nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng, hàm lượng và chất lượng carrageenan của các dịng rong thuộc lồi rong Bắp sú thu thập được ở vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh sau gần hai mươi năm di trồng.
Những bụi rong khỏe, không trầy xước, màu sắc tươi sáng của hai dòng rong nâu Sacol và nâu Payaka thuộc lồi rong Bắp sú đang được ni trồng ở vịnh Vân
Phong và vịnh Cam Ranh được chọn lọc và rửa tại hiện trường nhiều lần. Rong được giữ ẩm bằng vải ướt trong thùng xốp và vận chuyển bằng ơ tơ về phịng thí nghiệm Vật liệu Hữu cơ từ Tài nguyên biển. Sau đó, rong được giữ dưới điều kiện bán tự nhiên trong bể kính có thể tích 100 L chứa 80 L nước biển có sục khí, thay nước và rửa rong hàng ngày trong thời gian 2 – 3 ngày. Những ngày tiếp theo giãn dần khoảng cách thay nước và lưu giữ 2 tuần trước khi bố trí nghí nghiệm.
giữ ẩm bằng vải ướt và vận chuyển bằng ô tô đến địa điểm thí nghiệm ở vịnh Vân Phong và vịnh Cam Ranh. Mỗi dịng rong được thí nghiệm với 30 bụi (100 g/bụi). Các bụi rong được buộc vào dây với khoảng cách giữa các bụi rong là 40 cm, cố định vào giàn và đặt xuống biển có độ sâu 50 cm được ni bằng hình thức giàn phao nổi (Vịnh Vân Phong) hoặc sử dụng phương pháp giàn căng cố định (Vịnh Cam Ranh), Khánh Hòa [144]. Đo nhiệt độ (°C), độ mặn (‰), pH và thu mẫu nước (để xác định hàm lượng khoáng) vào lúc 6 giờ và 14 giờ, ngoại trừ CĐAS được tính trung bình ngày ở tuần ni thứ 0, 2, 4, 6, 8, 10 và 12.
2.3.3.3. Tạo nguồn vật liệu
Thử nghiệm các loại môi trường dinh dưỡng đối với sự sinh trưởng của rong
giống trong điều kiện in vitro giai đoạn thuần hóa
Một dịng rong thuộc lồi rong Bắp sú có đặc điểm sinh học tốt nhất được nuôi trồng ở vùng sinh thái phù hợp dựa theo kết quả của thí nghiệm trên được chọn để làm thí nghiệm. Rong khỏe màu nâu tươi sáng, có nhiều nhánh thứ cấp, đã được giữ 2 tuần trong điều kiện bán tự nhiên theo mô tả ở trên. Sau đó, dùng dao mổ cắt thành những mẫu có kích thước khoảng 5 cm, khối lượng khoảng 1,2 g. Các mẫu rong này được nuôi dưới điều kiện in vitro trong bình thủy tinh 500 mL có chứa 400 mL các loại môi trường dinh dưỡng như: PES; PES ½; ½ PES (Phụ lục 1.4.2) [77]; MPI; MPI ½; ½ MPI (Phụ lục 1.4.3) [78]; MS; MS ½ và ½ MS (Phụ lục 1.4.1) [79] và đối chứng (không bổ sung dinh dưỡng) nhằm xác định loại mơi trường thích hợp trong giai đoạn ni thuần hóa rong giống. Mơi trường nuôi trồng là các môi trường dinh dưỡng được pha bằng nước biển có độ mặn 30 – 35‰ đã được lọc qua lưới có kích thước lỗ 22 µm. Mơi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở 121oC với thời gian 20 phút. Các bình thủy tinh có lắp sục khí. Thay nước sau mỗi 1 tuần đồng thời bổ sung dinh dưỡng. Thí nghiệm được bố trí với mỗi nghiệm thức là 3 bình thủy tinh chứa 10 nhánh rong/bình.
Khử trùng mẫu in vitro
Thu nhận và tiền xử lý mẫu: Những nhánh rong khỏe có màu sắc tươi sáng, có nhiều nhánh thứ cấp đã được thuần hóa trong phịng thí nghiệm 4 tuần, sử dụng dao mổ cắt thành những đoạn dài khoảng 5 cm. Sau đó, những đoạn rong này được khử
trùng thô trên bề mặt theo phương pháp của Reddy và cộng sự [48]. Các mẫu cấy được chuyển vào bình tam giác (có thể tích 250 mL) đậy kín bằng nút cao su và đưa vào tủ cấy vô trùng.
Thao tác khử trùng mẫu cấy: Rong đã được khử trùng thô bằng dung dịch nước tẩy rửa theo mô tả như trên. Trong tủ cấy, mẫu được rửa với nước biển vô trùng 4 – 5 lần, mỗi lần 5 phút. Tiếp đó, mẫu được khử trùng bằng nano bạc (Phụ lục 1.2) có bổ sung vài giọt Tween-80 hoặc kháng sinh (Phụ lục 1.2) với nồng độ, thời gian khác nhau tùy từng chất khử trùng và đối chứng (Natri hypochlorite) (Bảng 2.1). Cuối cùng, mẫu được rửa lại 4 – 5 lần bằng nước biển vô trùng trước khi cấy mẫu vào mơi trường. Mục đích của thí nghiệm này là đánh giá hiệu quả của loại chất khử trùng và thời gian xử lý mẫu đối với tỉ lệ nhiễm VSV, tỉ lệ mẫu sống và sạch VSV.
Bảng 2.1. Nồng độ, thời gian khử trùng bằng nano bạc và kháng sinh
Chất khử trùng Thời gian Nồng độ (%) Nano bạc 5 phút 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,10 10 phút 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,10 20 phút 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,10 30 phút 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,10 Kháng sinh 24 giờ 1; 2; 3; 4 Natri hypochlorite 15 phút 1
Sau khi khử trùng, tiến hành cắt nhỏ mẫu vơ trùng với kích thước 4 – 5 mm rồi đặt vào bình có chứa 20 mL môi trường PES (bổ sung 15 g.L-1 agar để làm đông môi trường) theo phương pháp của Reddy và cộng sự [48]. Những lọ chứa mẫu được đặt dưới điều kiện in vitro. Môi trường nuôi cấy là mơi trường PES được pha bằng nước biển có độ mặn 30 – 35‰ đã được lọc qua lưới có kích thước lỗ 22 µm và bổ sung 15 g.L-1 agar (Algae culture agar, Himedia, Ấn Độ). Môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở 121oC với thời gian 20 phút. Thí nghiệm được bố trí với mỗi nghiệm thức được cấy 30 bình, mỗi bình 1 mẫu.
2.3.3.4. Cảm ứng mô sẹo và nhân nhanh mô sẹo
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố nuôi cấy đến sự cảm ứng mô sẹo
Sử dụng mẫu đã được khử trùng bằng loại, nồng độ và thời gian khử trùng tối ưu ở thí nghiệm trên để làm nguyên liệu cho các thí nghiệm cảm ứng mơ sẹo. Cắt nhỏ
mẫu vơ trùng với kích thước 4 – 5 mm rồi đặt vào đĩa petri có chứa 40 mL mơi trường. Đĩa petri mang mẫu cấy được bọc kín bằng Parafilm nhằm tránh khơng khí bên ngồi lọt vào và đặt dưới điều kiện in vitro. Các yếu tố nuôi cấy được khảo sát là: (1) các loại mơi trường dinh dưỡng: PES; PES ½; ½ PES (Phụ lục 1.4.2) [77]; MPI; MPI ½; ½ MPI (Phụ lục 1.4.3) [78]; MS; MS ½ và ½ MS (Phụ lục 1.4.1) [79] và đối chứng (không bổ sung dinh dưỡng); (2) CĐHSTTV: Đơn lẻ hoặc kết hợp NAA (0,1; 1,0 mg.L-1) hoặc BAP (0,1; 1,0 mg.L-1) và đối chứng (không bổ sung NAA và BAP); (3) hàm lượng agar (Algae culture agar, Himedia, Ấn Độ): 5; 10; 15; 20 g.L-1; (4) CĐAS: 0; 5; 15; 35; 55 µmol photons.m-2.s-1 dưới ánh sáng trắng đèn huỳnh quang với số lượng đèn khác nhau để tìm ra điều kiện cảm ứng mô sẹo. Môi trường nuôi cấy là các mơi trường dinh dưỡng được pha bằng nước biển có độ mặn 30 – 35‰ đã được lọc qua lưới có kích thước lỗ 22 µm và bổ sung 15 g.L-1 agar (Algae culture agar, Himedia, Ấn Độ). Tùy vào mục đích từng thí nghiệm mà có sự điều chỉnh hàm lượng agar, môi trường dinh dưỡng và các CĐHSTTV phù hợp.Môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở 121oC với thời gian 20 phút. Các thí nghiệm được tiến hành độc lập, mỗi thí nghiệm bố trí với mỗi nghiệm thức gồm 3 đĩa petri, mỗi đĩa petri chứa 10 mẫu.
Ảnh hưởng của các loại môi trường dinh dưỡng, NAA và BAP đối với khả năng
nhân nhanh mô sẹo
Cụm mô sẹo 8 tuần tuổi thu từ thí nghiệm trên được cắt thành những mẫu có kích thước khoảng (5 x 5 mm) và khối lượng 30 mg được đặt vào đĩa petri có chứa 40 mL môi trường. Đĩa petri mang mẫu cấy được bọc kín bằng Parafilm nhằm tránh khơng khí bên ngồi lọt vào và đặt dưới điều kiện in vitro. Các yếu tố nuôi cấy được khảo sát là: (1) các loại mơi trường dinh dưỡng: PES; PES ½; ½ PES (Phụ lục 1.4.2) [77]; MPI; MPI ½; ½ MPI (Phụ lục 1.4.3) [78]; MS; MS ½ và ½ MS (Phụ lục 1.4.1) [79] và đối chứng (không bổ sung dinh dưỡng); (2) CĐHSTTV: Đơn lẻ hoặc kết hợp NAA (1; 2; 3 mg.L-1) hoặc BAP (1; 2; 3 mg.L-1) và đối chứng (không bổ sung NAA hoặc BAP) nhằm xác định được môi trường phù hợp trong giai đoạn nhân nhanh mô sẹo rong Bắp sú. Môi trường nuôi cấy là các môi trường dinh dưỡng được pha bằng nước biển có độ mặn 30 – 35‰ đã được lọc qua lưới có kích thước lỗ 22 µm và bổ sung 15 g.L-1 agar (Algae culture agar, Himedia, Ấn Độ). Tùy vào mục đích từng thí nghiệm mà có sự điều chỉnh mơi trường dinh dưỡng và các CĐHSTTV phù hợp. Môi
trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở 121oC với thời gian 20 phút. Các thí nghiệm được tiến hành độc lập, mỗi thí nghiệm được bố trí với mỗi nghiệm thức gồm 3 đĩa petri, mỗi đĩa petri chứa 10 mẫu.
2.3.3.5. Sự phát sinh phơi vơ tính từ mơ sẹo
Cụm mơ sẹo 16 tuần tuổi của rong Bắp sú được lấy từ kết quả của thí nghiệm nhân nhanh mơ sẹo có kích thước khoảng 2 x 2 mm và khối lượng khoảng 10 mg sau đó được đặt vào đĩa petri có chứa 40 mL môi trường PES đặc (15 g.L-1 agar); hoặc môi trường PES bán lỏng (4 g.L-1 agar); hoặc môi trường PES lỏng nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của độ rắn môi trường đối với khả năng phát sinh phôi vơ tính từ mơ sẹo rong Bắp sú. Sau đó, sử dụng trạng thái vật lí mơi trường tối ưu ở trên, bổ sung đơn lẻ hoặc kết hợp NAA (1; 2; 3 mg.L-1) hoặc BAP (1; 2; 3 mg.L-1) và đối chứng (không bổ sung NAA hoặc BAP) nhằm xác định được loại và nồng độ CĐHSTTV phù hợp đối với khả năng phát sinh phơi vơ tính từ mơ sẹo rong Bắp sú.
Môi trường nuôi cấy là các môi trường dinh dưỡng được pha bằng nước biển có độ mặn 30 – 35‰ đã được lọc qua lưới có kích thước lỗ 22 µm. Tùy vào mục đích từng thí nghiệm mà có sự điều chỉnh hàm lượng agar và các CĐHSTTV phù hợp. Môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở 121oC với thời gian 20 phút. Đối với nghiệm thức môi trường PES đặc và PES bán lỏng, mỗi nghiệm thức được cấy 3 đĩa petri, mỗi đĩa petri chứa 10 mẫu. Ở nghiệm thức mơi trường PES lỏng được cấy vào 30 bình cầu đáy bằng 100 mL có chứa 40 mL mơi trường, mỗi bình cầu chứa 1 mẫu. Các đĩa petri và bình cầu đáy bằng chứa mẫu cấy được đặt dưới điều kiện in vitro.
2.3.3.6. Khả năng tái sinh cây con và thích nghi điều kiện sống tự nhiên
Ảnh hưởng của một số yếu tố đối với khả năng tái sinh cây con từ phơi vơ tính
Những mẫu có chứa các phơi vơ tính rong Bắp sú được ni cấy trong bình cầu đáy bằng 250 mL có chứa 200 mL mơi trường PES lỏng và được lắc 100 vòng/phút trong thời gian 2 tuần. Sau khi các phôi rời nhau, tiến hành lọc và chọn những phơi đồng đều nhau có kích thước 0,5 – 0,6 mm, có đặc tính khỏe để làm các thí nghiệm tái sinh cây con. Các yếu tố nuôi cấy được khảo sát là: (1) các loại mơi trường dinh dưỡng: PES; PES ½; ½ PES (Phụ lục 1.4.2) [77]; MPI; MPI ½; ½ MPI (Phụ lục 1.4.3) [78]; MS; MS ½ và ½ MS (Phụ lục 1.4.1) [79] và đối chứng (không
bổ sung dinh dưỡng); (2) sự xáo trộn của nước: Lắp hệ thống sục khí, hoặc đặt lên máy lắc có tốc độ lắc lần lượt là 50 vòng/phút và 100 vòng/phút; (3) CĐAS: 0; 15; 35; 55; 75 µmol photons.m-2.s-1 dưới ánh sáng trắng đèn huỳnh quang; (4) độ mặn: 20; 25; 30; 35; 40‰; (5) nhiệt độ: 20; 25; 27; 30; 35°C được kiểm tra để tìm ra điều kiện tái sinh cây con tốt nhất. Môi trường nuôi trồng là các môi trường dinh dưỡng được pha bằng nước biển đã được lọc qua lưới có kích thước lỗ 22 µm. Tùy vào mục đích từng thí nghiệm mà có sự điều chỉnh độ mặn và mơi trường dinh dưỡng.Môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở 121oC với thời gian 20 phút. Các thí nghiệm được tiến hành độc lập, mỗi thí nghiệm được bố trí với mỗi nghiệm thức ba bình cầu đáy bằng có thể tích 250 mL chứa 200 mL mơi trường, mỗi bình cầu chứa 10 phơi.
Giai đoạn thích nghi ngồi tự nhiên của cây con có nguồn gốc in vitro
Giai đoạn cuối cùng của nhân giống in vitro là chuyển cây con ra ngồi điều kiện ni trồng tự nhiên. Tỉ lệ sống sót của cây khi chuyển ra điều kiện ex vitro được quyết định bởi nhiều yếu tố như tình trạng sinh lý của cây, kích thước cây con và các yếu tố môi trường như nguồn ánh sáng. Trong các yếu tố đó, kích thước cây con và nguồn ánh sáng đóng vai trị rất quan trọng quyết định tỉ lệ sống sót của cây ở giai