2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.3.4. Cảm ứng mô sẹo và nhân nhanh mô sẹo
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố nuôi cấy đến sự cảm ứng mô sẹo
Sử dụng mẫu đã được khử trùng bằng loại, nồng độ và thời gian khử trùng tối ưu ở thí nghiệm trên để làm nguyên liệu cho các thí nghiệm cảm ứng mơ sẹo. Cắt nhỏ
mẫu vơ trùng với kích thước 4 – 5 mm rồi đặt vào đĩa petri có chứa 40 mL mơi trường. Đĩa petri mang mẫu cấy được bọc kín bằng Parafilm nhằm tránh khơng khí bên ngồi lọt vào và đặt dưới điều kiện in vitro. Các yếu tố nuôi cấy được khảo sát là: (1) các loại mơi trường dinh dưỡng: PES; PES ½; ½ PES (Phụ lục 1.4.2) [77]; MPI; MPI ½; ½ MPI (Phụ lục 1.4.3) [78]; MS; MS ½ và ½ MS (Phụ lục 1.4.1) [79] và đối chứng (không bổ sung dinh dưỡng); (2) CĐHSTTV: Đơn lẻ hoặc kết hợp NAA (0,1; 1,0 mg.L-1) hoặc BAP (0,1; 1,0 mg.L-1) và đối chứng (không bổ sung NAA và BAP); (3) hàm lượng agar (Algae culture agar, Himedia, Ấn Độ): 5; 10; 15; 20 g.L-1; (4) CĐAS: 0; 5; 15; 35; 55 µmol photons.m-2.s-1 dưới ánh sáng trắng đèn huỳnh quang với số lượng đèn khác nhau để tìm ra điều kiện cảm ứng mô sẹo. Môi trường nuôi cấy là các môi trường dinh dưỡng được pha bằng nước biển có độ mặn 30 – 35‰ đã được lọc qua lưới có kích thước lỗ 22 µm và bổ sung 15 g.L-1 agar (Algae culture agar, Himedia, Ấn Độ). Tùy vào mục đích từng thí nghiệm mà có sự điều chỉnh hàm lượng agar, môi trường dinh dưỡng và các CĐHSTTV phù hợp.Môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở 121oC với thời gian 20 phút. Các thí nghiệm được tiến hành độc lập, mỗi thí nghiệm bố trí với mỗi nghiệm thức gồm 3 đĩa petri, mỗi đĩa petri chứa 10 mẫu.
Ảnh hưởng của các loại môi trường dinh dưỡng, NAA và BAP đối với khả năng
nhân nhanh mô sẹo
Cụm mô sẹo 8 tuần tuổi thu từ thí nghiệm trên được cắt thành những mẫu có kích thước khoảng (5 x 5 mm) và khối lượng 30 mg được đặt vào đĩa petri có chứa 40 mL môi trường. Đĩa petri mang mẫu cấy được bọc kín bằng Parafilm nhằm tránh khơng khí bên ngồi lọt vào và đặt dưới điều kiện in vitro. Các yếu tố nuôi cấy được khảo sát là: (1) các loại mơi trường dinh dưỡng: PES; PES ½; ½ PES (Phụ lục 1.4.2) [77]; MPI; MPI ½; ½ MPI (Phụ lục 1.4.3) [78]; MS; MS ½ và ½ MS (Phụ lục 1.4.1) [79] và đối chứng (không bổ sung dinh dưỡng); (2) CĐHSTTV: Đơn lẻ hoặc kết hợp NAA (1; 2; 3 mg.L-1) hoặc BAP (1; 2; 3 mg.L-1) và đối chứng (không bổ sung NAA hoặc BAP) nhằm xác định được môi trường phù hợp trong giai đoạn nhân nhanh mô sẹo rong Bắp sú. Môi trường nuôi cấy là các môi trường dinh dưỡng được pha bằng nước biển có độ mặn 30 – 35‰ đã được lọc qua lưới có kích thước lỗ 22 µm và bổ sung 15 g.L-1 agar (Algae culture agar, Himedia, Ấn Độ). Tùy vào mục đích từng thí nghiệm mà có sự điều chỉnh mơi trường dinh dưỡng và các CĐHSTTV phù hợp. Môi
trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở 121oC với thời gian 20 phút. Các thí nghiệm được tiến hành độc lập, mỗi thí nghiệm được bố trí với mỗi nghiệm thức gồm 3 đĩa petri, mỗi đĩa petri chứa 10 mẫu.
2.3.3.5. Sự phát sinh phơi vơ tính từ mơ sẹo
Cụm mô sẹo 16 tuần tuổi của rong Bắp sú được lấy từ kết quả của thí nghiệm nhân nhanh mơ sẹo có kích thước khoảng 2 x 2 mm và khối lượng khoảng 10 mg sau đó được đặt vào đĩa petri có chứa 40 mL môi trường PES đặc (15 g.L-1 agar); hoặc môi trường PES bán lỏng (4 g.L-1 agar); hoặc môi trường PES lỏng nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của độ rắn môi trường đối với khả năng phát sinh phôi vô tính từ mơ sẹo rong Bắp sú. Sau đó, sử dụng trạng thái vật lí mơi trường tối ưu ở trên, bổ sung đơn lẻ hoặc kết hợp NAA (1; 2; 3 mg.L-1) hoặc BAP (1; 2; 3 mg.L-1) và đối chứng (không bổ sung NAA hoặc BAP) nhằm xác định được loại và nồng độ CĐHSTTV phù hợp đối với khả năng phát sinh phơi vơ tính từ mơ sẹo rong Bắp sú.
Môi trường nuôi cấy là các mơi trường dinh dưỡng được pha bằng nước biển có độ mặn 30 – 35‰ đã được lọc qua lưới có kích thước lỗ 22 µm. Tùy vào mục đích từng thí nghiệm mà có sự điều chỉnh hàm lượng agar và các CĐHSTTV phù hợp. Môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở 121oC với thời gian 20 phút. Đối với nghiệm thức môi trường PES đặc và PES bán lỏng, mỗi nghiệm thức được cấy 3 đĩa petri, mỗi đĩa petri chứa 10 mẫu. Ở nghiệm thức môi trường PES lỏng được cấy vào 30 bình cầu đáy bằng 100 mL có chứa 40 mL mơi trường, mỗi bình cầu chứa 1 mẫu. Các đĩa petri và bình cầu đáy bằng chứa mẫu cấy được đặt dưới điều kiện in vitro.
2.3.3.6. Khả năng tái sinh cây con và thích nghi điều kiện sống tự nhiên
Ảnh hưởng của một số yếu tố đối với khả năng tái sinh cây con từ phơi vơ tính
Những mẫu có chứa các phơi vơ tính rong Bắp sú được ni cấy trong bình cầu đáy bằng 250 mL có chứa 200 mL mơi trường PES lỏng và được lắc 100 vòng/phút trong thời gian 2 tuần. Sau khi các phôi rời nhau, tiến hành lọc và chọn những phơi đồng đều nhau có kích thước 0,5 – 0,6 mm, có đặc tính khỏe để làm các thí nghiệm tái sinh cây con. Các yếu tố nuôi cấy được khảo sát là: (1) các loại mơi trường dinh dưỡng: PES; PES ½; ½ PES (Phụ lục 1.4.2) [77]; MPI; MPI ½; ½ MPI (Phụ lục 1.4.3) [78]; MS; MS ½ và ½ MS (Phụ lục 1.4.1) [79] và đối chứng (không
bổ sung dinh dưỡng); (2) sự xáo trộn của nước: Lắp hệ thống sục khí, hoặc đặt lên máy lắc có tốc độ lắc lần lượt là 50 vòng/phút và 100 vòng/phút; (3) CĐAS: 0; 15; 35; 55; 75 µmol photons.m-2.s-1 dưới ánh sáng trắng đèn huỳnh quang; (4) độ mặn: 20; 25; 30; 35; 40‰; (5) nhiệt độ: 20; 25; 27; 30; 35°C được kiểm tra để tìm ra điều kiện tái sinh cây con tốt nhất. Môi trường nuôi trồng là các môi trường dinh dưỡng được pha bằng nước biển đã được lọc qua lưới có kích thước lỗ 22 µm. Tùy vào mục đích từng thí nghiệm mà có sự điều chỉnh độ mặn và môi trường dinh dưỡng.Môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở 121oC với thời gian 20 phút. Các thí nghiệm được tiến hành độc lập, mỗi thí nghiệm được bố trí với mỗi nghiệm thức ba bình cầu đáy bằng có thể tích 250 mL chứa 200 mL mơi trường, mỗi bình cầu chứa 10 phơi.
Giai đoạn thích nghi ngồi tự nhiên của cây con có nguồn gốc in vitro
Giai đoạn cuối cùng của nhân giống in vitro là chuyển cây con ra ngồi điều kiện ni trồng tự nhiên. Tỉ lệ sống sót của cây khi chuyển ra điều kiện ex vitro được quyết định bởi nhiều yếu tố như tình trạng sinh lý của cây, kích thước cây con và các yếu tố môi trường như nguồn ánh sáng. Trong các yếu tố đó, kích thước cây con và nguồn ánh sáng đóng vai trị rất quan trọng quyết định tỉ lệ sống sót của cây ở giai đoạn thích nghi để cây con quen với điều kiện tự nhiên. Kích thước cây con phù hợp để đưa ra ngồi ni trồng ở điều kiện tự nhiên giúp tăng tỉ lệ sống sót và giảm chi phí sản xuất. Bên cạnh đó, thiết lập một hệ thống cung cấp ánh sáng phù hợp cho từng loại cây con in vitro để cây thích nghi với điều kiện ánh sáng tự nhiên trước khi chuyển ra điều kiện ex vitro đảm bảo cho cây quang hợp và sinh trưởng tốt.
Cây con 8 tuần tuổi có nguồn gốc in vitro, kích thước khoảng 2,5 cm, khối
lượng khoảng 1 g và 5 – 8 nhánh được cố định vào mảnh vụn san hô hoặc đá, đặt trong bể kính có thể tích 100 L, kích thước 25 x 35 x 50 cm, sục khí liên tục, có hệ thống điều nhiệt để đạt được nhiệt độ 25 – 27°C và đặt dưới các nguồn ánh sáng khác nhau (Bảng 2.2) nhằm khảo sát ảnh hưởng của nguồn ánh sáng đối với khả năng sinh trưởng cây con có nguồn gốc in vitro ở giai đoạn thích nghi bán tự nhiên. CĐAS của các nguồn ánh sáng khác nhau được xác định vào 12 giờ trưa và được đo tại đáy bể. Chu kì chiếu sáng 10 giờ/ngày đối với các nghiệm thức sử dụng hệ thống chiếu sáng. Theo dõi sự phát triển của rong và màu nước hàng ngày. Môi trường nuôi trồng là mơi trường PES được pha bằng nước biển có độ mặn 30 – 35‰ đã được lọc qua lưới
có kích thước lỗ 22 µm. Thay nước và bổ sung mơi trường dinh dưỡng 1 tuần/lần. Thí nghiệm được bố trí với mỗi nghiệm thức 3 bể kính, mỗi bể kính chứa 10 cây.
Bảng 2.2. Các thơng số nguồn ánh sáng khác nhau
Nguồn ánh sáng Đặc điểm CĐAS (µmol photons.m-2.s-1) 1 Ánh sáng trắng đèn huỳnh quang 55 2 Ánh sáng trắng đèn huỳnh quang 75 3 Đèn led 150
4 Ánh sáng tự nhiên có giảm ½ CĐAS bằng mái che
(mái tơn trong và lưới màu xanh đen) 250
5 Ánh sáng tự nhiên 500
Cùng với nguồn ánh sáng, loại cây con cũng được kiểm tra. Cây con 8 tuần tuổi có nguồn gốc in vitro với các kích thước, số nhánh và khối lượng khác nhau được chuyển ra nuôi trồng ex vitro nhằm khảo sát ảnh hưởng của loại cây con có nguồn gốc in vitro đối với khả năng sinh trưởng ở giai đoạn thích nghi bán tự nhiên. Tiến hành theo dõi sáu loại cây con in vitro (Bảng 2.3).
Bảng 2.3. Các chỉ tiêu sinh trưởng của cây con in vitro trước khi thí nghiệm
Loại cây Số nhánh (nhánh/cây) Kích thước (cm) Khối lượng (g)
1 3,00 ± 1,00 0,52 ± 0,06 0,36 ± 0,08 2 4,33 ± 1,15 1,0 ± 0,09 0,53 ± 0,06 3 4,67 ± 0,58 1,49 ± 0,10 0,63 ± 0,12 4 6,00 ± 1,00 2,06 ± 0,16 0,86 ± 0,05 5 6,33 ± 0,58 2,52 ± 0,10 0,96 ± 0,05 6 6,67 ± 0,58 3,01 ± 0,12 1,23 ± 0,06
Rong được cố định vào mảnh vụn san hơ hoặc đá, đặt trong bể kính có thể tích 100 L, kích thước 25 x 35 x 50 cm, sục khí liên tục, có hệ thống điều nhiệt để đạt được nhiệt độ 25 – 27°C và được đặt dưới nguồn ánh sáng tối ưu ở thí nghiệm trên. Theo dõi sự phát triển của rong, màu nước hàng ngày. Môi trường nuôi trồng là môi trường PES được pha bằng nước biển có độ mặn 30 – 35‰ đã được lọc qua lưới có kích thước lỗ 22 µm. Thay nước và bổ sung mơi trường dinh dưỡng 1 tuần/lần. Thí nghiệm được bố trí với mỗi nghiệm thức 3 bể kính, mỗi bể chứa 10 cây.
giá chất lượng cây giống. Cây con có nguồn gốc in vitro đạt kích thước khoảng 50 – 70 g và đối chứng là rong có nguồn gốc ngồi tự nhiên đang sinh trưởng tốt có khối lượng khoảng 100 g. Các bụi rong này được tách thành những bụi có kích thước khoảng 50 g/bụi và được buộc vào dây. Khoảng cách giữa các bụi rong là 40 cm được cố định vào giàn và đặt xuống nước với độ sâu 50 cm [144]. Điều kiện nuôi trồng tự nhiên ở vịnh Vân Phong, Khánh Hịa. Thí nghiệm nhằm đánh giá khả năng thích nghi của cây con rong Bắp sú có nguồn gốc in vitro ở điều kiện sinh thái tự nhiên. Thí
nghiệm được bố trí với mỗi nghiệm thức 30 bụi cây/nguồn gốc giống.
Bước cuối cùng của nhân giống in vitro là đánh giá hàm lượng và chất lượng carrageenan của rong Bắp sú có nguồn gốc in vitro. Thu thập rong có nguồn gốc in
vitro và rong ngoài tự nhiên 10 tuần tuổi được ni ngồi tự nhiên ở vịnh Vân Phong.
Rong thu về được rửa sạch dưới vòi nước nhiều lần nhằm loại bỏ cát, đá, tảo tạp và sinh vật bám. Tiếp theo, rong được phơi khô dưới ánh sáng mặt trời. Những mẫu rong này được dùng để xác định hàm lượng và chất lượng carrageenan. Thí nghiệm nhằm đánh giá hàm lượng và chất lượng carrageenan của rong Bắp sú có nguồn gốc in vitro ni trồng ở điều kiện sinh thái tự nhiên.
2.3.4. Phương pháp quan sát giải phẫu hình thái thực vật
Việc quan sát q trình cảm ứng của mơ sẹo được thực hiện đồng thời với thí nghiệm ảnh hưởng của hàm lượng agar đối với q trình cảm ứng mơ sẹo. Các mẫu cấy trên đĩa petri được kiểm tra 2 ngày/lần để ghi nhận những mẫu cấy bị mất màu, nhiễm VSV và cảm ứng mơ sẹo. Hình dạng, màu sắc, trạng thái mơ sẹo được quan sát dưới kính hiển vi quang học và kính hiển vi soi nổi (Olympus, Nhật Bản) dưới vật kính có độ phóng đại ×10, ×20 và ×40.
Giải phẫu mơ sẹo: Cụm mơ sẹo được quan sát và chụp ảnh bằng máy ảnh và kính hiển vi quang học (SZH10 – Olympus, Nhật Bản). Sử dụng dao mổ để cắt mô sẹo ra khỏi mẫu cấy, lấy phần nhọn của dao mổ tách vài sợi mơ sẹo, đặt lên lam kính sau đó quan sát dưới kính soi nổi và quang học để đánh giá mức độ phân nhánh, hình thái tế bào và sự phát triển của mô sẹo.
Quan sát sự phát sinh phơi vơ tính: Theo dõi sự phát sinh phơi vơ tính hàng ngày và chụp ảnh bằng máy ảnh và kính hiển vi quang học (SZH10 – Olympus, Nhật
Bản). Lấy dao mổ cắt một lớp mỏng tế bào có độ dày khoảng 0,1 mm, làm tiêu bản bằng cách đặt lớp mỏng tế bào này lên lam kính, sau đó nhỏ một vài giọt nước biển đã khử trùng, đậy bằng lamen và soi dưới vật kính có độ phóng đại x10, x20 và x40.
2.3.5. Phương pháp ghi nhận số liệu
2.3.5.1. Các yếu môi trường
pH: Được xác định bằng máy pH/mV/Temperature meter (EC10, Hach Company – USA); độ mặn (‰): Đo bằng khúc xạ kế cầm tay (ATAGO Hand Refractomecter); CĐAS trung bình ngày được lấy từ thư viện Giovani [145] và được đo bằng máy đo CĐAS (Lutron, LM81LX, Đài Loan); nhiệt độ (oC): Được đo bằng nhiệt kế thủy ngân. Hàm lượng khoáng trong nước (NH4+, NO3-, PO43-…) được phân tích theo phương pháp so màu quang phổ (bằng máy HACH DR/2010, Mỹ) với bước sóng từ 400 – 950 nm.
2.3.5.2. Xác định khối lượng tươi và khô
Xác định khối lượng tươi của rong và mô sẹo: Khối lượng tươi của rong Bắp sú được xác định bằng cân đồng hồ có giới hạn là 500 g với độ chia nhỏ nhất 2 g và cân phân tích có giới hạn 200 g với độ chia nhỏ nhất 0,0001 g. Rong được thấm khô nước bằng giấy trước khi cân. Khối lượng tươi mô sẹo rong Bắp sú được xác định bằng cân phân tích có giới hạn 200 g với độ chia nhỏ nhất 0,0001 g.
Xác định khối lượng khô của rong và mô sẹo: Sau khi xác định khối lượng tươi, rong được sấy khô trong tủ sấy với nhiệt độ 60 – 70°C đến khi khối lượng không đổi rồi đem cân bằng cân phân tích có giới hạn 200 g với độ chia nhỏ nhất 0,0001 g.
2.3.5.3. Tốc độ tăng trưởng
TĐTT được tính theo cơng thức của Penniman và Mathieson [146] như sau: GR = [(Wt/Wo)1/t – 1] x 100
Trong đó: GR: TĐTT của rong Bắp sú (%/ngày), t: Thời gian giữa hai lần cân (ngày),
Wo: Khối lượng tươi ban đầu của rong (g), Wt: Khối lượng tươi sau thời gian t ngày (g).
2.3.5.4. Xác định chiều dài cây con và số nhánh/cây
Chiều dài cây con được xác định như sau: Cây rong được đặt trên khay nhựa phẳng. Đặt thước kẻ có chia vạch với độ sai số 1 mm dọc theo chiều dài cây rong. Chiều dài cây rong được tính từ đĩa bám đến đỉnh nhánh dài nhất của cây.
Xác định số nhánh/cây: Đếm số nhánh mọc ra từ đĩa bám.
2.3.5.5. Xác định hàm lượng và chất lượng carrageenan Xác định hàm lượng carrageenan Xác định hàm lượng carrageenan
Áp dụng theo mô tả của Istinii và cộng sự [138] về phương pháp xác định hàm lượng agar ở rong biển như sau: Cân 20 g rong khô, thêm 400 mL 6% KOH ở 80°C rồi nấu trong 2 giờ, sau đó rong được nấu với 400 mL nước cất ở 90°C trong 2 giờ. Tiếp theo, dung dịch được lọc bằng vải để tách nước, dịch chiết được gel hóa bằng KCl 0,2%, đơng lạnh và rã đơng ít nhất 2 lần. Cuối cùng carrageenan được làm khô ở 60°C đến khối lượng không đổi.
Đánh giá chất lượng của carrageenan (sức đông và độ nhớt)
Đo sức đông và độ nhớt carrageenan với nồng độ 1,5% bằng máy Rheo Meter, Model CR - 500DX, Sun Scientific Co, Ltd dựa theo mơ tả của Stanley [148] về phân tích đặc tính chất lượng carrageenan từ rong biển.
Đo sức đông: Cân 1,5 g carrageenan, bổ sung 100 mL nước cất rồi gia nhiệt ở 70°C trong 30 phút. Cho dịch vào đĩa petri sao cho đầy đĩa, sau 3 tiếng đĩa đơng. Sau đó đặt đĩa petri chứa carrageenan lên máy đo sức đơng và đo tại 3 vị trí trên đĩa.
Đo độ nhớt: Cân 1,5 g carrageenan, bổ sung 100 mL nước cất rồi gia nhiệt ở