3.2. Nhân giống dòng rong nâu Sacol thuộc loài rong Bắp sú
3.2.1.2. Khử trùng mẫu invitro
Sau 1 tuần nuôi cấy, kết quả ghi nhận được cho thấy khả năng khử trùng mẫu khác nhau ở các nồng độ nano bạc, kháng sinh và thời gian xử lý khác nhau. Khử trùng bằng nano bạc ở nồng độ 0,05% trong thời gian 5 phút thì hiệu quả khử trùng
là tốt nhất, với tỉ lệ mẫu nhiễm VSV thấp và tỉ lệ mẫu sống và sạch VSV cao (Bảng 3.3 và Hình 3.4).
Nồng độ và thời gian khử trùng bằng nano bạc ảnh hưởng đến tỉ lệ nhiễm VSV và tỉ lệ mẫu sống và sạch VSV. Khi khử trùng mẫu bằng nano bạc ở nồng độ 0,05 – 0,10% trong thời gian 5 – 20 phút thì có tỉ lệ mẫu sạch VSV là 100%. Tuy nhiên, ở nồng độ cao và thời gian kéo dài thì mẫu bị đỏ thân hoặc teo lại; sau khoảng 1 tuần mẫu bị hoại tử. Ở nghiệm thức 0,05% trong thời gian 5 phút thì mẫu có tỉ lệ sống sạch VSV cao đạt 80,00% và mẫu vẫn giữ được màu sắc tự nhiên. Ở nồng độ khử trùng thấp hơn với thời gian tương tự, chất lượng rong mẫu vẫn tốt nhưng tỉ lệ mẫu sạch VSV thấp. Tương tự, khử trùng mẫu bằng kháng sinh cũng cho tỉ lệ mẫu sạch VSV cao (93,3 – 96,7%) nhưng tỉ lệ mẫu sống và sạch VSV thấp (63,33 – 66,67%) ở nồng độ 1 – 2% trong thời gian 24 giờ. Tỉ lệ mẫu sạch VSV cao ở nghiệm thức sử dụng Natri hypochlorite nhưng mẫu thường đỏ thân sau 2 – 3 ngày nuôi cấy, hoại tử hoàn toàn sau 7 ngày ni cấy (Bảng 3.3 và Hình 3.4).
Như vậy, chất khử trùng Natri hypochlorite không phù hợp để khử trùng mẫu rong Bắp sú. Trong thí nghiệm này, hiệu quả khử trùng bằng kháng sinh ở nồng độ thấp hơn và trong thời gian ngắn hơn khi so với rong Sụn. Rong Sụn được khử trùng với 3% kháng sinh trong thời gian hai ngày đạt 90 – 95% mẫu rong vô trùng và mẫu cấy phát triển tốt [48]. Tương tự, 90% mẫu rong Gelidiella acerosa sạch VSV khi
khử trùng bằng 3,5% kháng sinh trong 2 ngày [153]. Nồng độ cao và thời gian khử trùng dài, mẫu sạch hoàn tồn nhưng làm tổn thương lớp biểu bì của rong và hỗn hợp kháng sinh thẩm thấu vào thân rong thông qua những vết cắt và cuối cùng rong bị tẩy trắng, hoại tử sau vài ngày ni cấy. Điều này có thể giải thích, sức chịu đựng với các chất khử trùng của rong phụ thuộc vào nguồn gốc và sinh lí của từng lồi rong; chất có hoạt tính bề mặt như chất tẩy rửa đã làm giảm sức căng bề mặt của rong và VSV, vì thế hạn chế sự dính chặt của VSV lên bề mặt rong [154].
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc, kháng sinh và thời gian xử lý lên tỉ lệ mẫu nhiễm VSV và tỉ lệ mẫu sống và sạch VSV của dòng rong nâu Sacol, n = 30
Chất khử trùng Thời gian Nồng độ (%) Tỉ lệ mẫu nhiễm VSV (%) Tỉ lệ mẫu sống sạch VSV (%) Mơ tả hình thái Nano bạc 5 phút
0,02 86,7a ± 5,8 10,00hi ± 10,00 Mẫu cấy giữ được màu sắc tự nhiên, mẫu nhiễm nhiều 0,03 56,7b ± 5,8 30,00fg ± 10,00 Mẫu cấy giữ được màu sắc tự nhiên
0,04 50,0b ± 0,0 33,33ef ± 5,77 Mẫu cấy giữ được màu sắc tự nhiên
0,05 0,0e ± 0,0 80,00a ± 3,33 Mẫu cấy giữ được màu sắc tự nhiên, sạch VSV, tỉ lệ sống cao
0,10 0,0e ± 0,0 63,33b ± 5,77 Mẫu cấy giữ được màu sắc tự nhiên, sạch VSV
10 phút
0,02 80,0a ± 0,0 20,00gh ± 10,00 Mẫu cấy giữ được màu sắc tự nhiên, tỉ lệ nhiểm VSV cao 0,03 56,7b ± 5,8 43,33de ± 5,77 Mẫu cấy giữ được màu sắc tự nhiên
0,04 10,0d ± 10,0 66,67b ± 5,77 Tỉ lệ nhiễm VSV thấp, mẫu giữ được màu sắc tự nhiên 0,05 0,0e ± 0,0 60,00bc ± 10,00 Tỉ lệ nhiễm VSV thấp, mẫu giữ được màu sắc tự nhiên 0,10 0,0e ± 0,0 6,67i ± 5,77 Mẫu cấy mất màu, mất nươc và hoại tử nhiều sau 1 tuần nuôi
15 phút
0,02 33,3c ± 5,8 63,33b ± 5,77 Mẫu cấy giữ được màu sắc tự nhiên 0,03 26,7c ± 5,8 60,00bc ± 10,00 Mẫu cấy giữ được màu sắc tự nhiên 0,04 6,7d ± 5,8 66,67b ± 5,77 Mẫu cấy giữ được màu sắc tự nhiên 0,05 0,0e ± 0,0 66,67b ± 5,77 Mẫu cấy giữ được màu sắc tự nhiên
0,10 0,0e ± 0,0 6,67i ± 5,77 Mẫu cấy bị teo, mất màu hoại tử nhiều sau 1 tuần cấy
20 phút
0,02 23,3c ± 5,8 50,00cd ± 10,00 Mẫu cấy giữ được màu sắc tự nhiên
0,03 10,0d ± 10,0 43,33de ± 5,77 Mẫu cấy bị teo, mất màu hoại tử nhiều sau 1 tuần nuôi cấy 0,04 0,0e ± 0,0 33,33ef ± 5,77 Mẫu cấy bị teo, mất màu hoại tử nhiều sau 1 tuần nuôi cấy 0,05 0,0e ± 0,0 26,67fg ± 5,77 Mẫu cấy bị teo và mất màu, hoại tử nhiều sau 1 tuần nuôi cấy 0,10 0,0e ± 0,0 3,33i ± 5,77 Mẫu cấy bị teo, mất màu hoại tử nhiều sau 1 tuần nuôi cấy
Kháng sinh 24 giờ
1 6,7d ± 5,8 66,67b ± 1,92 Mẫu cấy có màu sắc tự nhiên 2 3,3e ± 5,8 63,33b ± 5,77 Mẫu cấy có màu sắc tự nhiên
3 0,0e ± 0,0 43,33de ± 5,77 Mẫu có hiện tượng mất màu, hoại tử sau 1 tuần cấy 4 0,0e ± 0,0 0,00i ± 0,00 Mẫu mất màu, hoại tử sau 1 tuần cấy
Natri hypochlorite 15 phút 1 60,3b ± 10,0 0,00 ± 0,00 Mẫu mất màu và hoại tử hoàn toàn sau 1 tuần cấy Ghi chú: Các chữ cái khác nhau (a, b, c…) trên cùng một cột thể hiện sự khác biệt thống kê với phép thử Ducan (với p < 0,05).
Hình 3.4. Hình thái của mẫu cấy dịng rong nâu Sacol được khử trùng bằng nano bạc, kháng sinh và thời gian xử lý khác nhau sau 1 tuần nuôi cấy. Thước: 2mm
A, B, C, D: Mẫu được khử trùng lần lượt với thời gian 5; 10; 15; 20 phút. Từ trái sang
phải, mẫu được khử trùng bằng nano bạc với nồng độ 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,1%
E: Mẫu được khử trùng bằng kháng sinh 1; 2; 3; 4% trong thời gian 24 giờ F: Mẫu được khử trùng bằng Natri hypochlorite 1% trong thời gian 15 phút
Đối với nano bạc, sau khi khử trùng 5 phút, có thể sử dụng ngay mẫu để cảm ứng mô sẹo. Bằng cách sử dụng nano bạc để khử trùng mẫu, kết quả đã tiết kiệm được thời gian khử trùng mẫu. Khử trùng mẫu bằng kháng sinh thông thường phải mất 1 – 3 ngày [48], thậm chí phải ngâm mẫu 7 ngày [155]. Mặc dù kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong nhân giống in vitro rong biển cho tỉ lệ mẫu sạch VSV cao nhưng có thể gây ra hiện tượng kháng kháng sinh ở thực vật, đồng thời thời gian khử trùng kéo dài. Các chất khử trùng khác có thời gian khử trùng ngắn, nhưng đều là chất độc hại đối với cơ thể con người. Sử dụng kháng sinh trong mơi trường ni cấy có thể ảnh hưởng tới người thí nghiệm và mơi trường. Dư lượng kháng sinh trong rong có thể ảnh hưởng đến sức khỏe của con người. Nano bạc là chất kháng khuẩn tốt, tiêu diệt các loài vi khuẩn, vi rút và bào tử nấm nhưng không độc hại đối với cơ thể con người. Do đó, nano bạc được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như y học, mỹ phẩm và dược phẩm… Như vậy, việc chứng minh sử dụng nano bạc như là một chất tác nhân mới để thay thế các chất khử trùng truyền thống khác, là một trong những điểm mới của luận án đạt được. Mẫu được khử trùng bằng nano bạc với nồng độ 0,05% trong thời gian 5 phút được sử dụng trong tất cả các thí nghiệm tiếp theo.