Mẫu máu bệnh nhân NHL Tách gen mã hóa kháng nguyên CD20
Tạo kháng nguyên CD20 tái tổ hợp Gây miễn dịch gà bằng kháng nguyên CD20
Thu nhận gen mã hóa kháng thể scFv đặc hiệu CD20 từ gà gây miễn dịch Tạo kháng thể scFv
Kết quả tổng hợp gen antiCD20 mã hóa scFv
Thiết kế vector biểu hiện pET- 22b(+)/antiCD20
Tối ƣu điều kiện biểu hiện scFv trong vector pET-22b(+).
Tinh sạch scFv
Xác định độ ổn định của scFv
Tạo kháng thể scFv-CH2
Tổng hợp gen antiCD20Fa mã hóa
scFv-CH2
Sàng lọc hệ vector biểu hiện (pET28a,
pET30GB1, MBP)
Tối ƣu điều kiện biểu hiện scFv-CH2
trong vector đã chọn (pET28a)
Tinh sạch scFv-CH2
Xác định độ ổn định của scFv-CH2 Khả năng liên kết của scFv-CH2 với
CD20
Thử nghiệm scFv-CH2 phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân ung thƣ lympho khơng Hodgkin
Hình 3.1. Ảnh điện di tách RNA tổng số từ bệnh phẩm
1-3: RNA tổng số tách từ máu của các bệnh nhân ung thƣ lympho không Hodgkin
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TẠO KHÁNG NGUYÊN CD20 TÁI TỔ HỢP
3.1.1. Tách chiết RNA tổng số từ máu bệnh nhân ung thƣ lympho không Hodgkin Hodgkin
RNA tổng số đƣợc tách chiết bằng kit S.N.A.P (Invitrogen) và điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, việc kiểm tra RNA trên gel agarose đánh giá sơ bộ độ tinh sạch của RNA. RNA tổng số sau khi tách chiết từ 3 mẫu bệnh phẩm của các bệnh nhân NHL đƣợc trình bày trên hình 3.1.
Ở ngƣời, các tiểu phần rRNA 28S; 18S; 5,8S là chủ yếu [87]. Do đó khi điện di RNA tổng số có thể xuất hiện 3 băng sáng hơn trên các đƣờng chạy điện di, tƣơng ứng với các tiểu phần rRNA. Kết quả điện di từ các mẫu đã tách chiết có xuất hiện 3 băng tƣơng ứng. Nhƣ vậy có thể khẳng định, RNA tổng số đã đƣợc tách chiết từ các mẫu bệnh phẩm. Theo tính tốn lí thuyết mRNA chiếm tỉ lệ nhỏ (2-8%) trong mẫu RNA tổng số [87] nhƣng cũng đủ để nhân bản gen quan tâm khi sử dụng phản ứng PCR phiên mã ngƣợc (RT - PCR) với RNA tổng số.
Hình 3.2. Ảnh điện di nhân bản gen mã hoá cho CD20
1: Marker DNA; 2: Sản phẩm RT-PCR nhân gen CD20
3.1.2. Nhân bản gen mã hố CD20
Sau khi có đƣợc RNA tổng số, DNA mang trình tự mã hóa cho CD20 đƣợc tạo ra bằng RT-PCR sử dụng kit “one-step RT-PCR” (Invitrogen) với cặp mồi đặc hiệu CD20F/CD20R chứa vị trí cắt của 2 enzyme giới hạn NdeI và XhoI. Hai
enzyme này đƣợc thiết kế nằm ở 2 đầu ngồi cùng để thuận lợi cho việc nhân dịng và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên CD20.
Điện di (Hình 3.2) cho thấy trên đƣờng chạy thứ 2 xuất hiện một băng sáng đậm, so với thang DNA chuẩn thì băng này nằm trong khoảng 750 bp và 1000 bp (1 kb). Kết quả này phù hợp với tính tốn lý thuyết về độ dài của gen mã hoá cho CD20 dài khoảng 900 bp. Nhƣ vậy, gen mã hóa cho CD20 đã đƣợc nhân bản. Tuy nhiên, để khẳng định chắc chắn cần phải tách dịng và xác định trình tự gen đã nhân bản và so sánh với trình tự các gen đã cơng bố trong GenBank.
3.1.3. Tách dịng gen mã hoá CD20
Sau khi nhân bản đoạn gen mã hóa cho CD20 và kiểm tra trên gel 1% agarose tiến hành tách dòng đoạn DNA này. Q trình tách dịng đƣợc thực hiện bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm phản ứng RT-PCR vào vector tách dòng pCR 2.1 (Invitrogen), sau đó biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli chủng TOP10 và tách chiết DNA plasmid để chọn dòng tái tổ hợp mang đoạn gen mã hóa cho CD20.
Hình 3.3. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn NdeI và XhoI M: Marker DNA 100bp; 1-2: 2 dòng plasmid đƣợc cắt với enzyme NdeI và XhoI
Trên đĩa cấy trải chủng đã biến nạp xuất hiện nhiều khuẩn lạc trắng (có khả năng mang các vector tái tổ hợp) và một số khuẩn lạc xanh (chứa các plasmid tự đóng vịng). Vì vậy, để xác định dịng plasmid tái tổ hợp nào mang sản phẩm RT- PCR (gen CD20) cần phải cắt kiểm tra plasmid từ các khuẩn lạc trắng bằng các enzyme giới hạn NdeI và XhoI và so sánh kích thƣớc của đoạn cắt với sản phẩm RT-PCR.
Theo nhƣ thiết kế trên đoạn gen ngoại lai (gen CD20) đã có sẵn 2 vị trí nhận biết của NdeI và XhoI. Do đó, khi plasmid pCR2.1/CD20 đƣợc xử lí bằng NdeI và XhoI, enzyme này cắt rời đoạn DNA ngoại lai khỏi vector tái tổ hợp.
Hai plasmid tách chiết từ 2 khuẩn lạc trắng đƣợc xử lí bằng enzyme giới hạn đều xuất hiện một đoạn DNA có kích thƣớc xấp xỉ 900bp (tƣơng đƣơng sản phẩm phản ứng RT-PCR) (Hình 3.3).
Nhƣ vậy, sản phẩm RT-PCR đã gắn đƣợc vào vector tách dòng pCR2.1. Tuy nhiên, để khẳng định gen mã hóa cho kháng nguyên CD20 đã đƣợc tách dịng thành cơng cần xác định trình tự nucleotide của sản phẩm RT-PCR.
3.1.4. Xác định trình tự gen mã hóa CD20
Dịng plasmid tái tổ hợp đƣợc chọn để tách và tinh sạch gen mã hoá CD20 sau đó xác định trình nucleotide của gen này.
Sau khi phân tích và so sánh trình tự thu đƣợc với các trình tự đã công bố trong EMBL và GenBank (phụ lục 1.2), protein suy diễn tƣơng đồng với 9 trình tự từ 96,6% đến 100% trong đó có 1 trình tự tƣơng đồng 99,7% so với kháng nguyên CD20 của tế bào B với mã số P11836.
Nhƣ vậy, trình tự gen CD20 có chiều dài 900 bp đã đƣợc tách dịng thành
cơng. Đây là giai đoạn rất quan trọng để thực hiện các công việc tiếp theo trong đề tài. Dựa trên trình tự đoạn gen CD20 đã thu để thiết kế vector biểu hiện kháng
nguyên CD20.
3.1.5. Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên CD20
Vector pET-21a(+) đƣợc chọn làm hệ vector biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên CD20. Vector này có chứa 1 đoạn 6 amino acid histidin rất thuận tiện cho việc thu và tinh sạch protein tái tổ hợp.
Đoạn gen CD20 và vector pET-21a(+) mở vòng đƣợc thu hồi theo kit của QIAGEN (Hình 3.4). Trên ảnh điện di cho thấy đoạn gen CD20 (~ 900 bp) và vector pET-21a(+) mở vòng đã thu đạt nồng độ và độ tinh sạch cần thiết cho phản ứng ghép nối để tạo vector tái tổ hợp pET-21a(+)/CD20.
Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm cắt và tinh sạch gen CD20, vector pET-21a(+) M: Marker DNA 1 kb; 1: Gen mã hóa CD20 sau khi xử lí bằng NdeI và XhoI