1: protein sau cảm ứng IPTG
3.5.3. Tối ƣu một số điều kiện biểu hiện scFv-CH
Để thu đƣợc lƣợng lớn kháng thể scFv-CH2, chủng E. coli chứa plasmid tái
tổ hợp (pET28a/antiCD20Fa) cần đƣợc nuôi cấy trong các điều kiện thích hợp nhất (nồng độ IPTG, thời gian thu mẫu sau cảm ứng IPTG, nhiệt độ, mật độ quang học).
Ảnh hƣởng của IPTG
Chủng E. coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp pET28a/antiCD20Fa đƣợc cảm ứng bởi IPTG ở các nồng độ 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 1 mM. Sau 5 h cảm ứng thu mẫu và điện di protein kiểm tra kết quả (Hình 3.33). Hàm lƣợng kháng thể tái tổ hợp theo tính tốn có kích thƣớc ~ 43 kDa ở các nồng độ IPTG từ 0,1 – 1 mM gần nhƣ khơng khác nhau (Hình 3.32). Do vậy, nồng độ IPTG là 0,3 mM đƣợc lựa chọn để tối ƣu hàm lƣợng protein.
Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy
Trong nghiên cứu này, chủng E. coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp
(pET28a/antiCD20Fa) đƣợc nuôi cấy ở 22oC; 30oC và 37oC cùng thu mẫu sau 5 h cảm ứng và nồng độ IPTG 0,3 mM (Hình 3.33).
Nhiệt độ có ảnh hƣởng đến khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp (kháng thể scFv- CH2). Ở 30oC băng protein ~ 43 kDa xuất hiện đậm nhất (đƣờng số 1), ở 37oC băng protein này xuất hiện ít hơn (đƣờng số 3) và ở 22oC gần nhƣ không thấy xuất hiện băng protein quan tâm (đƣờng số 2) (Hình 3.33). Nhƣ vậy, ni cấy chủng E.
coli chứa vector tái tổ hợp ở 30oC biểu hiện protein cao hơn ở 37oC và 22oC. Kết
Hình 3.33. Ảnh điện di mức độ biểu hiện của scFv-CH2 theo nhiệt độ M: marker; 4: Trƣớc cảm ứng IPTG; 1: 30oC; 2: 22oC; 3: 37oC
Hình 3.32. Ảnh hƣởng của IPTG đến mức độ biểu hiện của scFv-CH2 M: marker; 1: Trƣớc cảm ứng IPTG
với kháng thể scFv tạo ra trƣớc đây (37oC) và các nghiên cứu của Chou [33], Peti [100] và Graslund [59].
Ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn
Tế bào E. coli mang plasmid tái tổ hợp (pET28a/antiCD20Fa) đƣợc ni
hoạt hóa ở các thời gian là 1 h, 2 h, 3 h và 4 h. Sau đó, đo mẫu ở bƣớc sóng 600 nm để biết mật độ quang học. Kết quả đo OD600nm sau:1 h; 2 h; 3 h; 4 h ni hoạt hóa có giá trị OD600nm lần lƣợt là 0,3; 0,9; 1,3; 1,9. Tiếp tục bổ sung IPTG nồng độ 0,3 mM, thu mẫu sau 5 h cảm ứng ở 30oC.
Mật độ quang học không ảnh hƣởng rõ rệt đến mức độ biểu hiện kháng thể scFv-CH2 (Hình 3.34). Cả 4 đƣờng chạy 1-4 đều xuất hiện băng protein tái tổ hợp kích thƣớc ~ 43 kDa. Kết quả khảo sát nồng độ OD trƣớc khi cảm ứng để biểu hiện kháng thể scFv-CH2 khác với OD của kháng thể scFv (OD600 nm: 1,2). Mặt khác theo nghiên cứu của Francis và cộng sự (2010) nồng độ OD tốt nhất trƣớc cảm ứng là OD600nm: 0,6-0,9 [55]. Vì vậy, thời gian ni hoạt hóa trƣớc khi cảm ứng IPTG để biểu hiện scFv-CH2 đƣợc lựa chọn là 2h (OD600 nm: 0,9).
Hình 3.34. Ảnh điện di mức độ biểu hiện scFv-CH2 theo mật độ vi khuẩn M: Marker; 5: Trƣớc cảm ứng IPTG; 1: 2: 3: 4: tƣơng ứng thời gian nuôi vi khuẩn
Ảnh hƣởng của thời gian cảm ứng IPTG
Tế bào E. coli mang plasmid tái tổ hợp đƣợc nuôi cấy ở 30oC, nồng độ IPTG 0,3 mM và ni hoạt hóa trong 2 h trƣớc cảm ứng. Thu mẫu tại các thời điểm 2 h, 5 h và 15 h (nuôi qua đêm) sau cảm ứng.
Hàm lƣợng protein tái tổ hợp ~ 43 kDa thu đƣợc sau 2 h và 5 h cảm ứng ít hơn mẫu thu sau 15 h (Hình 3.35). Nhƣ vậy, thời gian cảm ứng tốt nhất của kháng thể scFv-CH2 (15 h) có sự khác biệt với kháng thể scFv (5 h). Điều này có thể do sự khác nhau về trình tự, kích thƣớc và vector biểu hiện kháng thể. Vì vậy, thời gian thu mẫu sau khi cảm ứng IPTG là 15 h đƣợc lựa chọn để biểu hiện kháng thể scFv- CH2.