1: protein sau cảm ứng IPTG
3.5.2.3. Chọn vector biểu hiện scFv-CH
Các vector đều có khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp, tuy nhiên để lựa chọn đƣợc vector biểu hiện kháng thể scFv-CH2 có hàm lƣợng cao nhất cần phải tiến hành Western blot.
Theo nhƣ thiết kế, scFv-CH2 tái tổ hợp gắn thêm 6-histidine ở 2 đầu. Dựa vào đặc điểm này có thể xác định hoạt tính liên kết của kháng thể scFv-CH2 tạo ra với kháng thể cộng hợp kháng đi histidine (Hình 3.31).
Vector pET28a (đƣờng số 1) và vector pET30GB1 (đƣờng số 2) xuất hiện băng kích thƣớc nằm trong khoảng 40-55 kDa, tuy nhiên kích thƣớc protein của đƣờng số 1 (~ 43 kDa) thấp hơn và xuất hiện đậm hơn đƣờng số 2 (~ 50 kDa), vector MBP (đƣờng số 3, 4) không xuất hiện băng kích thƣớc ~ 85 kDa theo tính tốn lí thuyết (Hình 3.31).
Nhƣ vậy, kháng thể tái tổ hợp từ vector pET28a có hoạt tính liên kết với kháng thể cộng hợp cao nhất so với 2 vector MBP, pET30GB1. Mặt khác kháng thể tạo ra từ pET28a không gắn đoạn protein dung hợp nên sau khi tinh sạch protein này không phải loại bỏ phần protein dung hợp mà có thể tiến hành ngay các nghiên cứu về chẩn đoán bệnh.
Sau khi sơ bộ kiểm tra khả năng biểu hiện và xác định hoạt tính của kháng
Hình 3.31. Hình ảnh Western blot của kháng thể scFv-CH2 ở 3 vector biểu hiện M: Marker protein; 1: pET28a; 2: pET30GB1; 3, 4: MBP
tính liên kết với kháng thể cộng hợp cao nhất so với 2 vector pET30GB1/antiCD20Fa và MBP/antiCD20Fa. Vì vậy, Vì vậy, pET28a đƣợc lựa chọn làm vector biểu hiện gen antiCD20Fa và vector tái tổ hợp pET28a/antiCD20Fa đƣợc chọn để xác định trình tự.
Trong 2 dòng chọn đƣợc (khuẩn lạc) chứa vector tái tổ hợp pET28a/antiCD20Fa, sản phẩm PCR với mồi T7 của dòng thứ 2 (đƣờng chạy số 6 – Hình 3.29) đƣợc chọn để xác định trình tự trên máy xác định trình tự ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer.
Trình tự DNA và protein suy diễn kháng thể scFv-CH2 đặc hiệu CD20 (phụ lục 3) cho thấy, đoạn gen ngoại lai antiCD20Fa gắn vào vector pET28a đã có đầy đủ mã mở đầu (ATG), mã kết thúc (TGA), 2 đoạn gen mã hóa cho 6-histidine , đoạn liên kết VH-VL (linker: SSGGGGSGGGGSGS) và các phần khác nhƣ thiết kế. Nhƣ vậy có thể khẳng định gen mã hóa kháng thể scFv-CH2 đã gắn vào vector biểu hiện pET28a đúng chiều và đúng khung đọc.