1: protein sau cảm ứng IPTG
3.4.5. Khả năng liên kết của scFv với kháng thể cộng hợp Kết quả Dot blot
Kết quả Dot blot
Dot blot là kĩ thuật đƣợc sử dụng để thăm dò các nucleotide và các kháng thể (nhƣ Western blot). Kĩ thuật này tiết kiệm thời gian và đơn giản nhƣ: khơng phải sắc kí hay điện di protein trên gel polyacrylamide và khơng có các bƣớc xử lí với gel. Kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên CD20 đƣợc gắn đuôi 6-histidin rất thuận lợi cho việc tinh sạch và thăm dò kháng thể tái tổ hợp [55].
Ở đây, Dot blot đƣợc sử dụng để xác định khả năng liên kết của kháng thể scFv tái tổ hợp với kháng thể cộng hợp gắn đặc hiệu với đi 6-histidine trên màng PVDF (Hình 3.25). Ba mẫu protein tinh sạch (2, 3, 4) xuất hiện màu xám trên màng, mẫu đối chứng âm là nƣớc không xuất hiện màu chứng tỏ kháng thể scFv antiCD20 đã gắn đặc hiệu với kháng thể cộng hợp trên màng PVDF.
Hình 3.25. Hình ảnh Dot blot của kháng thể scFv đặc hiệu CD20 1: Đối chứng; 2 – 4: Kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu CD20 Hình 3.24. Nồng độ imidazol thu kháng thể scFv khi tinh sạch
M: Maker; 1: Trƣớc cảm ứng; 2: Sau cảm ứng; 3: 100 mM; 4, 5: 250 mM; 6, 7: 350 mM; 8, 9: 500 mM 3: 100 mM; 4, 5: 250 mM; 6, 7: 350 mM; 8, 9: 500 mM
Kết quả Western blot
Dot blot đã xác định đƣợc hoạt tính liên kết của protein đích (kháng thể scFv) (hình 3.25), tuy nhiên lại khơng xác định đƣợc kích thƣớc của protein. Trong khi đó Western blot lại cho biết kích thƣớc của protein quan tâm.
Ở nghiên cứu này, Western blot đƣợc sử dụng để kiểm tra tính đặc hiệu của kháng thể tái tổ hợp (protein đích) sản xuất đƣợc với kháng thể cộng hợp (mua) gắn đặc hiệu với đi 6-histidine của protein đích (Hình 3.26). Trên màng xuất hiện băng kích thƣớc ~ 30 kDa điều này chứng tỏ kháng thể scFv tái tổ hợp phản ứng đặc hiệu với kháng thể cộng hợp kháng đuôi 6-histidine (Ni-NTA conjugate).
Từ kết quả Dot blot và Western blot bƣớc đầu có thể xác định đƣợc khả năng liên kết của kháng thể scFv đặc hiệu kháng nguyên CD20 với kháng thể cộng hợp kháng đuôi histidine (Anti-6X His tag antibody (ab18184)).