1: protein sau cảm ứng IPTG
3.4.4. Tinh sạch kháng thể scFv đặc hiệu CD20 Lựa chọn phƣơng pháp tinh sạch
Lựa chọn phƣơng pháp tinh sạch
Protein tái tổ hợp biểu hiện trong E. coli chủ yếu tồn tại ở 2 dạng hịa tan và
thể vùi. Vì vậy, trƣớc khi tiến hành tinh sạch protein, độ hòa tan của protein trong dung dịch phá màng tế bào E.coli đƣợc xác định để lựa chọn phƣơng pháp tinh sạch có hiệu quả. 1 ml dịch ni tế bào sau khi cảm ứng IPTG đƣợc li tâm thu cặn, cặn này đƣợc hịa lại bằng 500 µl dung dịch đệm và siêu âm khoảng 5-10 phút để phá vỡ tế bào. Thu 40 µl dịch vừa siêu âm (protein tổng số), dịch còn lại đem li tâm 1200 vòng/phút trong 15 phút thu 2 phần (phần hịa tan và phần cặn). Sau đó đem điện di protein tổng số, phần hòa tan và phần cặn, trên gel polyacrylamid để kiểm tra mức độ hòa tan của protein (Hình 3.22).
Kết quả điện di cho thấy protein tái tổ hợp xuất hiện ở các giếng: phần tổng số (4), phần hòa tan (3), phần cặn (2), cịn giếng trƣớc cảm ứng (1) khơng xuất hiện băng protein kích thƣớc ~ 30 kDa. Điều này chứng tỏ protein tái tổ hợp kháng CD20 tồn tại ở cả 2 dạng hòa tan và thể vùi.
Sau khi xác định đƣợc độ hòa tan, kháng thể scFv đặc hiệu CD20 đƣợc tinh sạch theo phƣơng pháp khơng biến tính. Tuy nhiên, tinh sạch theo phƣơng pháp này
Hình 3.22. Ảnh điện di mức độ hòa tan của kháng thể scFv tái tổ hợp M: marker protein; 1: Trƣớc cảm ứng IPTG; 2: Phần cặn;
scFv lại đƣợc tinh sạch theo phƣơng pháp biến tính và trƣớc khi thu protein quan tâm từ cột Ni2+ protein đƣợc hồi tính bằng dịch đệm và điện di kiểm tra có xuất hiện băng protein quan tâm ~ 30 kDa (Hình 3.23.B). Phƣơng pháp biến tính đƣợc lựa chọn để tinh sạch kháng thể tái tổ hợp.
Tối ƣu nồng độ imidazol
6 histidine là một trong các đuôi phổ biến nhất đƣợc sử dụng để dễ dàng tinh sạch protein tái tổ hợp. Trong quá trình tinh sạch cột Ni2+ có thể gắn các protein khơng có đi histidine đặc hiệu do đó khi thu protein có thể lẫn protein đích với các protein khơng cần thiết. Thơng thƣờng, các protein tạp có ái lực liên kết yếu hơn protein tái tổ hợp đích. Có một số cách để loại protein tạp, thứ nhất có thể tính tốn lƣợng hạt Ni2+ vừa đủ để gắn với lƣợng protein đích, thứ hai imidazol có thể sử dụng nhƣ một tác nhân cạnh tranh [67].
Để loại bỏ những protein không quan tâm và thu đƣợc lƣợng kháng thể tinh sạch cao nhất, nồng độ imidazol đƣợc tối ƣu trong dải 100, 250, 350, 500 mM. Ở nồng độ 500 mM kháng thể kích thƣớc ~ 30 kDa xuất hiện rõ nhất; sau đó đến nồng độ 350 mM, ở các nồng độ 100 mM và 250 mM imidazol băng protein quan tâm xuất hiện mờ hơn (Hình 3.24). Vì vậy, nồng độ imidazol 500 mM đƣợc lựa chọn để thu protein khi tinh sạch.
Hình 3.23. Ảnh điện di kháng thể scFv tái tổ hợp tinh sạch biến tính (B) và
khơng biến tính (A)
A: M: Maker protein; 3-7: Các phân đoạn thu protein, 1: trƣớc cảm ứng; 2: Sau cảm ứng B: 1-5: Các phân đoạn thu protein, 6: trƣớc cảm ứng