kháng nguyên CD20 thƣơng mại và CD20 trên tế bào lympho B (Raji). TN1 - TN6: Thí nghiệm 1 – thí nghiệm 6
CD20 biểu hiện trên dịng tế bào Daudi. Geng và cộng sự đã tách dòng gen mã hóa scFv và gắn thêm đoạn CH2 và CH3, scFv-Fc có hoạt tính liên kết với CD20 biểu hiện trên dịng tế bào Raji và cấu trúc khơng gian 3 chiều của scFv-Fc có ảnh hƣởng đến khả năng liên kết với kháng nguyên CD20 [56].
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tƣơng tự nghiên cứu của Anna và Geng và Fang là đã tạo đƣợc kháng thể tái tổ hợp dạng scFv-Fc và scFv-LDP kháng CD20 và kháng thể này có hoạt tính liên kết với CD20. Tuy nhiên, ở nghiên cứu này gen mã hóa scFv đƣợc tách dòng từ RNA của tủy gà đã gây miễn dịch với CD20, gen mã hóa scFv-CH2 đƣợc gắn vào vector biểu hiện pET28a. ScFv-CH2 có khối lƣợng ~ 43 kDa đƣợc biểu hiện ở E. coli (BL21), tinh sạch trên cột sắc kí ái lực Ni2+ và có khả năng liên kết với CD20 thƣơng mại (SB) và CD20 trên dòng tế bào Raji.
3.6. THỬ NGHIỆM scFv-CH2 PHÁT HIỆN CD20 TRONG HUYẾT THANH BỆNH NHÂN NHL
3.6.1. Phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân bằng Western blot
Kháng ngun CD20 có kích thƣớc khoảng 33–36 kDa [26], [48]. CD20 biểu hiện khoảng 85-90% ở bệnh NHL [52]. Theo các tác giả Thomas, Giles, Manshouri và Yang, CD20 đƣợc tìm thấy trong tủy sống và máu ngoại biên, huyết tƣơng và huyết thanh [57], [88], [118], [129].
Hiện nay, để có thể chẩn đốn sớm và đơn giản khi lấy mẫu xét nghiệm, ngồi ra có thể theo dõi sự tiến triển của bệnh trƣớc và sau khi điều trị thì một số nhà khoa học đã nghiên cứu xác định hàm lƣợng CD20 trong máu [15], huyết tƣơng [88] và huyết thanh bệnh nhân [57].
Trong thí nghiệm này, chúng tơi bƣớc đầu sử dụng kháng thể scFv-CH2 tạo ra để phát hiện CD20 có trong huyết thanh bệnh nhân NHL bằng phản ứng Western blot.
Trƣớc khi xác định ái lực của kháng thể scFv-CH2 với kháng nguyên CD20 trong huyết thanh thì huyết thanh của 3 bệnh nhân ung thƣ lympho không Hodgkin
(đã xét nghiệm hóa mơ miễn dịch: CD20 dƣơng tính) đƣợc điện di để xem có xuất hiện protein kích thƣớc bằng kích thƣớc của CD20 hay khơng? (Hình 3.41).
Ba mẫu bệnh nhân NHL xuất hiện protein có kích thƣớc ~ 35 kDa, cịn mẫu ngƣời bình thƣờng khơng thấy xuất hiện protein này. Nhƣ vậy khả năng protein này là kháng nguyên CD20.
Để khẳng định trong huyết thanh của 3 bệnh nhân NHL có kháng ngun CD20 chúng tơi tiến hành 2 thí nghiệm Western blot song song:
1) Huyết thanh – scFv-CH2 – Kháng thể cộng hợp kháng đuôi histidine
2) Huyết thanh – KTC (kháng thể kháng CD20 thƣơng mại) – Kháng thể cộng hợp kháng KTC
Phản ứng của huyết thanh với scFv-CH2 (thí nghiệm 1) và kháng thể kháng CD20 thƣơng mại (thí nghiệm 2) đều xuất hiện băng có kích thƣớc ~ 35 kDa (Hình 3.42). Kết quả nghiên cứu cho thấy scFv-CH2 tạo ra đã phát hiện đƣợc CD20 trong 3 mẫu huyết thanh NHL và sơ bộ đánh giá kháng thể scFv-CH2 tạo ra có khả năng liên kết với kháng nguyên CD20 tƣơng đƣơng với kháng thể kháng CD20 thƣơng mại. Kết quả Western blot xác định CD20 trong huyết thanh bệnh nhân ung thƣ lympho không Hodgkin trong nghiên cứu này cũng tƣơng tự nghiên cứu xác định
Hình 3.41. Ảnh điện di huyết thanh bệnh nhân NHL M: Marker protein; 1-3: 3 mẫu huyết thanh NHL;