tâm rất mờ. Vì vậy, nồng độ imidazol 250 mM đƣợc lựa chọn để thu protein khi tinh sạch.
Tinh sạch kháng thể scFv-CH2 bằng cột Ni2+
Kháng thể tái tổ hợp đƣợc tinh sạch theo phƣơng pháp khơng biến tính, thu protein trên cột sắc kí ái lực Ni2+ ở nồng độ 250 mM imidazol và thu 3 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1,5 ml. Sau khi tinh sạch xuất hiện băng protein kích thƣớc ~ 43 kDa (Hình 3.38). Nhƣ vậy, kháng thể scFv-CH2 tái tổ hợp đã đƣợc tinh sạch.
Hình 3.37. Ảnh điện di scFv-CH2 tinh sạch ở nồng độ imidazol trên cột Ni+2
M: Marker protein; 1: protein tổng số; 5: 50 mM; 4: 100 mM; 3: 250 mM; 2: 500 mM
Hình 3.38. Ảnh điện di scFv-CH2 tinh sạch
M: Marker protein; 1: trƣớc cảm ứng IPTG; 2: sau cảm ứng IPTG; 3-5: các phân đoạn thu protein 3-5: các phân đoạn thu protein
3.5.5. Độ ổn định của scFv-CH2 tinh sạch
Kháng thể scFv-CH2 đƣợc bảo quản bằng cách đông khô trên máy trong 10 h. Sau đó đo hàm lƣợng scFv-CH2 (protein) trên máy Nanodrop ở các thời gian (1 ngày, 15 ngày, 30 ngày và 45 ngày) và nhiệt độ bảo quản (4oC, - 20oC, - 80oC) (Hình 3.39).
Hàm lƣợng kháng thể scFv-CH2 tạo ra đem đông khô sau 1 ngày kiểm tra còn nhiều ở các nhiệt độ bảo quản 4oC, -20oC, -80oC (1,72 mg/ml) (Hình 3.39), hàm lƣợng kháng thể giảm dần sau 15, 30 và 45 ngày khi bảo quản ở 4oC, -20oC . Tuy nhiên, khi bảo quản ở -80oC, hàm lƣợng kháng thể gần nhƣ không giảm sau 15, 30 và 45 ngày (tƣơng ứng 1,7; 1,7; 1,69 mg/ml). Thí nghiệm này cho thấy, hàm lƣợng scFv-CH2 giảm đi chậm hơn so với scFv ở các điều kiện bảo quản trên, có thể scFv- CH2 có cấu trúc lớn hơn và ít vị trí nhạy cảm với protease so với scFv.
Nhƣ vậy, so với kháng thể scFv tạo ra trƣớc đó thì kháng thể scFv-CH2 có tính ổn định cao hơn hẳn và bảo quản tốt nhất ở -80oC sau khi đông khô.
3.5.6. Khả năng liên kết của scFv-CH2 với CD20
Một số nhà khoa học đã sử dụng phƣơng pháp ELISA để xác định khả năng liên kết của kháng thể kháng CD20 tạo ra với CD20 trên tế bào lympho B ác tính dịng Raji hay dịng Daudi nhƣ Anna [18], Geng [56] và Fang [51].
Hình 3.39. Biểu đồ hàm lƣợng scFv-CH2 bảo quản ở nhiệt độ và
thời gian khác nhau
Tƣơng tự, chúng tôi xác định khả năng liên kết của kháng thể scFv-CH2 tạo ra với CD20 bằng ELISA cạnh tranh. Phản ứng ELISA gồm có scFv-CH2, kháng nguyên CD20 tái tổ hợp thƣơng mại và tế bào ung thƣ máu dịng lympho B có biểu hiện CD20 (Raji) do Học viện Quân y cung cấp (hình 3.40A).
Kết quả ELISA cạnh tranh cho thấy, thí nghiệm 2 và 6 khơng có kháng thể scFv-CH2 xuất hiện màu và có giá trị OD450nm tƣơng ứng là 1,85 và 1,65. Các thí nghiệm 1, 5 (TN1, TN5) có kháng thể scFv-CH2 không xuất hiện màu (OD450nm tƣơng ứng là 0,059 và 0,06) và 2 thí nghiệm đối chứng (TN3 và TN4) cũng không xuất hiện màu (OD450nm tƣơng ứng là 0,056 và 0,061) thấp hơn hẳn thí nghiệm 2 và 6 (Hình 3.40B). Nhƣ vậy, qua phản ứng ELISA có thể khẳng định kháng thể scFv- CH2 tạo ra có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên CD20 thƣơng mại và CD20 trên tế bào lympho B ác tính dịng Raji.
Ở nghiên cứu của Anna và cộng sự [18], đoạn gen mã hóa scFv đƣợc tách dòng từ RNA của các tế bào lách chuột đã gây miễn dịch với CD20, đoạn gen mã hóa scFv-Fc đƣợc gắn vào vector biểu hiện pEE12. ScFv-Fc có khối lƣợng 104 kDa đƣợc biểu hiện, tinh sạch trên cột sắc kí ái lực protein A và có hoạt tính liên kết với
A B
Hình 3.40. Hình ảnh các tế bào lympho B và kết quả ELISA xác định khả năng liên
kết của kháng thể scFv-CH2 với CD20