3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.4.4.2. Phương pháp xác định tính chất sinh vật, hoá học của P multocida
* Kiểm tra hình thái vi khuẩn
- Tiến hành nhuộm gram
Cố định tiêu bản: lấy một la men kính sạch, nhỏ một giọt nước sinh lý trên la men kính, dùng que cấy lấy khuẩn lạc điển hình, trộn đều vi khuẩn với giọt nước sinh lý. Sau đó để khô tự nhiên hoặc hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn để cố định tiêu bản.
Nhuộm màu : Nhỏ một giọt tím tinh thể (crystian violet ), để một phút , loại bỏ thuốc nhuộm thừa , cố định màu bằng dung dịch lugol , để 1 phút, tẩy màu bằng nước cất . Nhuộm lại tiê u bản bằng dung dịch đỏ fuchs in, để 1 phút. Rửa nhanh bằn nước cất, để khô tự nhiên cho đến khô.
- Kiểm tra dưới kính hiển vi : Sau khi mẫu nhuộm đã khô , nhỏ một giọt dầu soi kính lên tiêu bản , đưa lên kính hiển vi soi ở độ phóng đại 1000 lần. Thấy vi khuẩn có dạng cầu trực khuẩn , hai đầu tròn, gram âm, bắt màu đậm ở hai đầu kích thước nhỏ .
56
Dịch ngoáy mũi
Thạch máu (Blood agar), 370C/24 giờ
Chọn khuẩn lạc điển hình
Kiểm tra đặc tính sinh vật – hóa học
Làm tiêu bản, nhuộm Gram Kiểm tra hình thái, tính chất bắt màu
Các phản ứng sinh hóa Oxidase (+), Catalase (+), Indol (+)
Lên men Lactose, Dung huyết
Pasteurella multocida Pasteurella haemolytica
Thử độc lực Kháng sinh đồ Giữ giống
Hình 2.2. Sơ đồ phân lập vi khuẩn Pasteurella
(Quinn và cs, 1994 [71] )
* Thử phản ứng Oxidase
Phản ứng được tiến hành trên giấy được thấm dung dịch Tetramethyl - Phenylene. Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch bôi lên mặt giấy
56
đã thấm thuốc thử. Nếu chỗ được bôi khuẩn lạc sau 10 giây xuất hiện màu đen tím là phản ứng dương tính. Nếu không xuất hiện màu đen tím hoặc không đổi màu là âm tính.
* Thử phản ứng Catalase
Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch bôi lên phiến kính sạch, nhỏ dung dịch H202 3 - 5% lên, trộn đều. Nếu có hiện tượng sủi bọt là dương tính.
* Thử phản ứng phân huỷ Urease
Cấy giống vi khuẩn cần thử vào ống môi trường urê và bồi dưỡng trong tủ ấm ở 370
C, sau 4 - 24 giờ thì đọc kết quả. Nếu dung dịch có màu hồng phản ứng dương tính, dung dịch không chuyển màu là phản ứng âm tính.
* Phản ứng sinh Indol
Cấy vi khuẩn cần thử vào môit trường Nutrient Broth sau đó bồi dưỡng trong tủ ấm ở 370C trong 24 giờ. Nhỏ 1 - 3 giọt Kovac dọc theo thành ống nghiệm. Nếu phản ứng dương tính sẽ xuất hiện 1 vòng đỏ nổi lên bề mặt.
* Phản ứng lên men đường
Phản ứng này cho phép kiểm tra tính chất lên men một số loại đường khác nhau của vi khuẩn cần giám định.
Trên nền môi trường dinh dưỡng không đường (Nutrient Broth), bổ sung thêm 1,5ml xanh Bromothymol 1,5% trong cồn, trong 100ml dung dịch. Hấp ướt 1100C trong 30 phút, để nguội đem chia vào các ống nghiệm 1×12cm, mỗi ống 3ml có ống Durham. Khi sử dụng cho thêm vào môi trường 0,2ml dung dịch đường cần kiểm tra đã vô trùng, cấy vi khuẩn vào và bồi dưỡng trong tủ ấm 370C trong vòng 24 giờ, sau đó đọc kết quả. Phản ứng cho kết quả dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ cánh sen, kết quả âm tính khi môi trường vẫn giữ nguyên màu sắc ban đầu.
56
* Phương pháp xác định type kháng nguyên của Pasteurella multocida
Xác định type vi khuẩn bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) - multiplex capsular PCR. Phản ứng sử dụng cặp mồi:
Primer sequences:
KTT72 5’-AGG-CTC-GTT-TGG-ATT-ATG-AAG-3’ KTSP61 5’-ATC-CGC-TAA-CAC-ACT-CTC-3’
Phản ứng gồm có các giai đoạn: Tiền biến tính ở 940
C/3phút và 30 chu kỳ nhiệt (biến tính 940C/3 phút, ủ bắt cặp 550
C/1 phút, kéo dài 720C/1 phút ) và kéo dài cuối cùng 720
C/7 phút.
Quá trình điện di được thực hiện trên gel agarose 2%, hiệu điện thế 100V trong 30 phút. Gel được nhuộm trong dung dịch EDTA đã bổ xung 1% ethidium bromide. Sau 15 phút, tiến hành đọc kết quả bằng hệ thống Gel-Doc 2000. Các vạch DNA được đánh giá bằng cách so sánh với DNA ladder chuẩn và mẫu đối chứng dương.