Phƣơng pháp nghiên cứu đáp ứng miễn dịch và độ dài miễn dịch

của đàn gia cầm sau tiêm vaccine H5N1

Dựa theo hƣớng dẫn và quy chế giám sát vật nuôi sau tiêm phòng, chúng tôi tiến hành giám sát đàn gia cầm sau khi tiêm vaccine ngoài thực địa.

2.3.2.1. Giám sát lâm sàng

- Khảo sát độ an toàn của vaccine đối với đàn gia cầm sau mỗi lần tiêm phòng, chúng tôi tiến hành theo dõi thông qua điều tra trực tiếp hai đàn gà và một đàn vịt thuộc 3 huyện trên địa bàn tỉnh.

2.3.2.2. Giám sát huyết thanh

- Đánh giá đáp ứng miễn dịch của các đàn gà nuôi tại một số huyện đã đƣợc tiêm vaccine H5N1 tại các thời điểm sau khi tiêm: 30 ngày, 60 ngày, 90 ngày, 120 ngày và 150 ngày

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn

- Đánh giá đáp ứng miễn dịch của các đàn vịt trong tỉnh đã đƣợc tiêm vaccine H5N1 tại các thời điểm sau khi tiêm: 30 ngày, 60 ngày, 90 ngày, 120 ngày.

2.3.2.3. Thu thập mẫu huyết thanh

Đối tƣợng lấy mẫu là huyết thanh gà, vịt đƣợc tiêm vaccine H5N1 đang đƣợc nuôi tại tỉnh Quảng Ninh.

Nhổ hết lông tại vị trí lấy máu (mặt dƣới cánh). Sát trùng bằng bông cồn cho nổi rõ tĩnh mạch cánh. Dùng bơm tiêm loại 5ml, chọc kim vào tĩnh mạch theo chiều hƣớng đầu kim vào phía trong cơ thể gia cầm, lấy từ 2-3ml máu/con, sau đó kéo dài pittong ra đến 5ml, bẻ gập đầu kim, đậy nắp kim lại, để nghiêng cho máu đông tự nhiên, chắt lấy huyết thanh.

Mẫu huyết thanh có thể để ở nhiệt độ 40C (bảo quản trong hộp xốp đựng đá)trong vòng 48 giờ, nếu bảo quản lâu hơn, giữ ở nhiệt độ - 200C.

Mẫu huyết thanh đƣợc vận chuyển tới phòng xét nghiệm của Cơ quan Thú y vùng II Hải phòng trong điều kiện lạnh (phích đá) càng sớm càng tốt, có phiếu gửi bệnh phẩm kèm theo.

* Gà, vịt chỉ báo: Gà, vịt trên địa bàn tỉnh Quảng Ninh không đƣợc tiêm vaccine cúm H5N1, dùng để làm đối chứng. Chúng tôi lấy mẫu huyết thanh của gà, vịt chỉ báo là 10 mẫu/ 1 huyện qua các thời điểm (30, 60, 90, 120, 150) sau tiêm để kiểm tra hiệu giá kháng thể. Từ đó rút ra kết luận đàn gà, vịt trong tỉnh có hiệu giá kháng thể là do miễn dịch tự hiên hay miễn dịch do vaccine.

* Chuẩn bị các dung dịch - Pha chế dung dịch PBS: NaCl 8g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,15 g KH2PO4 0,2 g Nƣớc cất vđ 1000 ml

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn theo tỷ lệ 1:1. - Dung dịch PBS 0,01M, pH 7,2 Na2HPO4 1,096 g NaH2PO4.H2O 0,316 g Na Cl 8,5 g Nƣớc cất 1000 ml

Chỉnh pH = 7,2 bằng NaOH 1N hoặc HCl 1N, hấp vô trùng, bảo quản 4oC không quá 3 tuần.

- Dung dịch nước muối sinh lý 0,85%:

Pha 8,5 g NaCl trong 1000 ml nƣớc cất. Hấp vô trùng, bảo quản 4oC không quá 3 tuần.

- Dung dịch hồng cầu gà 1%:

+ Máu gà trống khoẻ mạnh đã trƣởng thành, không có kháng thể kháng virus cúm và Newcastle.

+ Dùng bơm tiêm 5 - 10ml hút sẵn 1ml (10% thể tích) dung dịch chống đông (Natri Citrat 4%) rồi lấy máu gà vào ống nghiệm.

+ Ly tâm 1000 - 1500 vòng/phút, trong 15 phút, gạn bỏ huyết tƣơng, cho thêm nƣớc sinh lý (NaCl 0,85%) vào hồng cầu, lắc đều. Ly tâm nhƣ trên 3 - 4 lần để rửa hồng cầu, sau lần ly tâm cuối gạn bỏ nƣớc ở trên.

+ Pha hồng cầu với nƣớc muối sinh lý thành huyễn dịch 1%: pha 1 ml hồng cầu với 99 ml nƣớc muối sinh lý.

+ Bảo quản huyễn dịch hồng cầu ở nhiệt độ 4 - 8oC. Hồng cầu sau khi pha có thể dùng trong 4 - 5 ngày (nếu dung dịch hồng cầu bị dung huyết thì loại bỏ không dùng).

* Kháng huyết thanh chuẩn:

- Kháng huyết thanh chuẩn đƣợc chế tạo từ các loài đọng vật nhƣ thỏ, dê, cừu... cần đƣợc xử lý bằng RDE (Receptor Destroying Enzyme) trƣớc khi xét nghiệm.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn

- Kháng huyết thanh chuẩn đƣợc chế tạ ở gà thì không cần xử lý bằng RDE. Tuy nhiên, nếu phản ứng cho kết quả không rõ ràng thì kháng huyết thanh có thể xử lý RDE để khẳng định kết quả là dƣơng tính.

- Hoàn nguyên kháng huyết thanh và bảo quản ở nhiệt độ - 20oC, xử lý của yếu tố ức chế đặc hiệu kháng huyết thanh vô hoạt.

- Trộn 3 phần RDE với 1 phần kháng huyết thanh, ủ ở nhiệt độ 37oC trong nồi đun cách thuỷ qua đêm.

- Ủ tiếp ở nồi đun cách thuỷ nhiệt độ56oC/30 phút để vô hoạt RDE còn dƣ. - Kháng huyết thanh đã xử lý để nguội, cho thêm 6 phần nƣớc sinh lý (0,3ml HT + 1,8ml SL), độ pha loãng cuối cùng của kháng huyết thanh là 1/10.

2.3.2.4. Phản ứng ngưng kết hồng cầu HA

- Nhỏ 25 l PBS 0,01M vào đĩa TaKaShi 96 giếng chữ V từ giếng thứ 1 đến giếng thứ 12 của mỗi hàng.

- Cho 25 l huyết thanhvào giếng thứ 1.

- Pha loãng kháng nguyên bằng cách chuyển 25 l dung dịch huyết thanh từ giếng thứ 1 sang giếng thứ 2 và tuần tự đến giếng 11 thì bỏ đi 25 l.

- Nhỏ thêm 25 l PBS vào các giếng.

- Nhỏ 25lhồng cầu gà 1% vào tất cả các giếng trên. - Lắc đĩa bằng máy hoặc bằng tay

- Để đĩa TaKaShi ở nhiệt độ phòng 20oC, thời gian khoảng 20 - 30 phút. - Đọc kết quả: Hiệu giá HA của virus đƣợc tính ở độ pha loãng cao nhất vẫn có hiện tƣợng ngƣng kết hồng cầu.

Ví dụ: Nếu ở độ pha loãng1/128 còn có ngƣng kết thì hiệu giáHA là 1/128. + Nếu HA (+) dƣơng tính, chứng tỏ có virus. Tiếp tục giám định bằng phản ứng HI với kháng huyết thanh chuẩn của một số subtype H virus cúm A và kháng huyết thanh chuẩn Newcastle để xác định loại virus phân lập (Bộ NN và PTNT, 2005) 3.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn

2.3.2.5. Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI

Theo Bộ NN và PTNT (2005) 3 cách tiến hành phản ứng HI nhƣ sau: - Pha kháng nguyên 4HA/25l: lấy độ pha loãng cuối cùng có phản ứng ngƣng kết hồng cầu nhân với 4.

- Tiến hành phản ứng HI: Trên 1 đĩa TaKaShi có thể tiến hành phản ứng HI với nhiều kháng huyết thanh của các subtype khác nhau.

+ Nhỏ 25 l PBS vào các giếng của đĩa TaKaShi.

+ Nhỏ tiếp 25 lkháng huyết thanh vào giếng đầu tiên.

+ Pha loãng kháng huyết thanh theo cơ số 2, bằng cách chuyển 25 l kháng huyết thanh từ giếng 1 sang giếng 2 và tuần tự đến giếng 11 và bỏ đi 25lcuối cùng.

+ Nhỏ 25 l kháng nguyên 4HA đã chuẩn bị vào các giếng từ giếng 1 - 11. Thêm 25 l PBS vào hàng đối chứng hồng cầu (giếng 12).

+ Lắc đĩa và để ở nhiệt độ phòng 20 - 30 phút.

+ Nhỏ 25ldung dịch hồng cầu (1%) vào tất cả các giếng của đĩa + Lắc đều, để đĩa ở nhiệt độ phòng 40 phút.

- Đọc kết quả: phản ứng (+) dƣơng tính hồng cầu lắng xuống đáy. Nhƣ vậy, virus phân lập và kháng huyết thanh chuẩn tƣơng ứng với nhau.

Theo quy định 1361/KTY - DT ngày 02/12/2005 của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn: Ngƣỡng bảo hộ hiệu giá (HI) = 4 log2.

kháng thể cao hiệu giá (HI) > 4 log2. không đƣợc bảo hộ hiệu giá (HI) < 4 log2.

2.3.2.6. Phương pháp RT-PCR

* Phản ứng Real time RT - PCR:

Nguyên liệu:

- Nƣớc cất vô trùng (Rnase - free).

- ARN đối chứng dƣơng tính M, H5 và H7. - Cồn tuyệt đối.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn

- Isopropanol 99% tinh khiết. - Chloroform 99% tinh khiết.

- Trizol LS reagent (Invitrogen, cat #10296 - 010 hoặc 10296 - 028). - Kit chiết tách Qiagen Rneasy Extraction (cat # 74104 50 prep hoặc #74106 250 prep).

- Kit RT - PCR 1 bƣớc Qiagen (cat # 210210 hoặc 210212) hoặc Superscript RT - PCR One - Step RT - PCR với Platinium Taq DNA Polymerase (cat 10928 - 034 hoặc 10928 - 042, Invitrogen).

- Mẫu dò và primer.

Bảng 1. Trình tự chuỗi của mẫu dò và Primer cho RTRT - PCR phát hiện cúm gia cầm

Đặc hiệu Ký hiệu Trình tự chuỗi

M

(cho bất kỳ cúm A)

M + 25* 5’- AgA TgA gTC TTC TAA CCg Agg TCg - 3’

5’ Primer

M + 64* 5’- FAM - TCA ggC CCC CTC AAA gCC gA - TAMRA - 3’

Mẫu dò

M - 124* 5’- TgC AAA AAC ATC TTC Aag TCT CTg - 3’

3’Primer

H7 (BắcMỹ)

H7+ 1244* 5’- ATT ggA CAC gAg ACg CAA Tg - 3’

5’ Primer

H7 + 1281* 5’- FAM - TAA TgC TgA gCT gTT ggT ggC - TAMRA - 3’ Mẫu dò

H7 - 1342* 5’- TTC TgA gTC CgC AAg ATC TAT Tg - 3’

3’Primer

H5

H5 + 1456* 5’- ACg TAT gAC TAT CCA CAA TAC TCA - 3’

5’ Primer

H5 + 1637* 5’- FAM - TCA ACA gTg gCg AgT TCC CTA gCA -TAMRA - 3’ Mẫu dò

H5 - 1685* 5’- AgA CCA gCT ACC ATg ATT gC - 3’

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn

- Rnase Inhibitor, 40 unit/µl (Promega, cat # N2511 hoặc N2515). - MgCl2, 25µM (Promega, cat # A3511 hoặc A3513).

- Đệm TE pH 8.0, 1X, (Promega # V6231 hoặc V6232). - 14.3 M *β - mercaptoethanol (β - ME) (Sigma M6250).

- Hoạt chất phản ứng M và H5 cho AIV RRT - PCR đã đƣợc chuẩn bị bởi Cepheid để sử dụng cho các xét nghiệm M và H5. Mỗi hoạt chất phản ứng đủ cho 4 phản ứng loại 25µl. Mỗi giọt chứa primer và mẫu dò đặc hiệu, KCl, MgCl2, và đệm HEPES. Thêm vào đó giọt M gồm cả chất điều khiển trong (IC). Mục đích của IC là phát hiện một âm tính giả tạo ra từ các chất ức chế không đặc hiệu của quá trình phân gen.

- Chất điều khiển trong M là một ARN chuỗi đơn phiên mã dài 228 base. Nó chứa chuỗi bổ sung với primer tiến ở đầu 5’ và primer lùi ở đầu 3’ và một chuỗi bên trong (internal) để gắn với mẫu dò IC. Hạt M gồm có một mẫu dò đánh dấu F để phát hiện gen M, và mẫu dò đánh dấu Cal - Flour Red 610 cho IC.

- Hạt chất phản ứng H5 gồm có 2 primer tiến, một để phát hiện AIV H5 dòng Bắc Mỹ và một để phát hiện AIV H5 dòng Âu - Á chất phản ứng H5, một mẫu dò H5 đánh dấu FAM phát hiện đƣợc cả 2 dòng. Chất phản ứng đƣợc chia vào các ống 0,5µl có thể sử dụng để hoàn nguyên. Chất phản ứng đƣợc sử dụng với dNTP và enzyme của kit Qiagen RT - PCR onestep. Chất phản ứng có thể bảo quản trong túi thiếc ở 40C trong 6 tháng không cởi bỏ túi nếu chƣa sử dụng.

* Các bƣớc tiến hành:

Trƣớc khi làm RTRT-PCR, đặt các pipet, khay, đầu pipet,... vào buồng vô trùng sạch. Tƣơng tự, đặt các dụng cụ làm mẫu vào buồng vô trùng khác. Bật đèn tử ngoại trong nhiều giờ hoặc qua đêm để giảm tạp nhiễm ARN từ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn

pipet và các dụng cụ khác.

- Chiết tách ARN từ mẫu dịch ngoáy (phương pháp Qiagen RNeasy):

+ Lắc mạnh (bằng máy Votex) ống chứa dịch ngoáy và chuyển lƣợng 500 µl sang ống ly tâm nhỏ và ghi ký hiệu mẫu.

+ Cho 500 µl Qiagenđ buffer RLT có β - ME vào ống ly tâm trên. Lắc đều trên máy Votex.

+ Ly tâm (bằng máy Spindown) để dịch bệnh phẩm đọng trên nắp trôi xuống đáy ống. Cho 500 µl cồn ethanol 70%, lắc mạnh bằng Votex. Ly tâm lấy mẫu đã bị dung dải trong vòng 5 phút với tốc độ 5000 vòng ở nhiệt độ phòng.

+ Chuyển tất cả dịch nổi chứa mẫu bị dung dải sang cột RNeasy Qiagen đã ghi sẵn kí hiệu mẫu. Ly tâm trong vòng 15 giây tốc độ ≥ 8000 vòng ở nhiệt độ phòng. Kiểm tra dịch mẫu đã thấm qua cột lọc chƣa, lặp lại bƣớc này cho đến khi toàn bộ mẫu đã qua cột lọc.

+ Bổ sung 700 µl dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột RNeasy Qiagen, ly tâm trong 15 giây ở tốc độ ≥ 8000 vòng, thay ống thu mẫu mới (collection tube) vào cột lọc.

+ Cho 500 µl RPE buffer vào cột RNeasy và ly tâm trong 15 giây ở tốc độ ≥ 8000 vòng, thay ống thu mẫu mới vào cột lọc.

+ Lặp lại bƣớc trên 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer. Sau lần rửa cuối cùng thay ống thu mẫu mới loại 2µl vào cột lọc.

+ Ly tâm cột lọc trống không trong 2 phút ở tốc độ tối đa (khoảng 12.000 vòng /phút), bỏ ống thu mẫu.

+ Đặt cột lọc vào ống thu hoạch đã đƣợc ghi sẵn ký hiệu mẫu. Cho 50µl RNase free H2O vào cột lọc. Chú ý không đƣợc chạm đầu pipet vào mặt thạch Silica trong cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 1 phút. Tách RNA

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn

bằng cách ly tâm cột trong 1 phút ở 10.000 vòng /phút. Bỏ cột lọc RNeasy. + Bảo quản mẫu ARN thu đƣợc ở 40C trong thời gian ngắn trƣớc khi làm RTRT - PCR, nếu sau 24 giờ, mẫu nên bảo quản ở - 200C hoặc nhiệt độ thấp hơn.

- Chiết tách mẫu tổ chức bằng Trizol LS:

+ Cho 0,75 ml Trizol LS reagent (hoặc 1ml Trizol reagent) và 0,25 ml dịch bệnh phẩm (0,1 ml dịch bệnh phẩm nếu dùng Trizol reagent) vào ống 1,5 ml. lắc đều và để ở nhiệt độ phòng 5 phút.

+ Thêm 0,2 ml chloroform vào mỗi ống. Lắc mạnh trong 15 giây và để ở nhiệt độ phòng 5 phút.

+ Ly tâm ống ở nhiệt độ 12.000g trong 15 phút ở 40 C.

+ Chuyển phần nƣớc (khoảng 500 µl) sang ống microtube mới.

+Thêm 0,5 ml Isopropanol và lắc đều. Để 5 - 10 phút ở nhiệt độ phòng. + Ly tâm ống ở tốc độ 10.000 vòng trong 5 phút ở 40C, bỏ dung dịch trong ống đi.

+ Rửa ARN đọng ở đáy ống bằng cồn 80%, lắc mạnh và ly tâm với tốc độ 10.000 vòng trong 5 phút ở 40

C.

+ Bỏ dung dịch trong ống và làm khô ARN 10 phút ở nhiệt độ phòng và hoà tan lại với 30 µl nƣớc cất không có RNase hoặc nƣớc cất đã xử lý DEPC.

- Sao mã ngƣợc và PCR:

+ Trong buồng vô trùng sạch, chuẩn bị hỗn hợp nhân gen (master mix) với các thành phần sau đủ dùng cho số lƣợng mẫu cần xét nghiệm.

+ Quy trình này đƣợc áp dụng cho máy nhân gen Cepheid Smart Cycler (Cephied, Sunnyvale, CA).

+ Thông tin về khởi động và cài đặt chƣơng trình cho máy Smart Cycler có trong quyển hƣớng dẫn của hãng. Chế độ chạy RT - PCR cho máy

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn

Smart Cycler đƣợc hƣớng dẫn trong bảng 2 và 3.

Bảng 2. Chu kỳ nhiệt của bƣớc phiên mã ngƣợc (RT) dùng cho Quiagen one step RT - PCR kit

Bƣớc phiên mã ngƣợc Thời gian (phút)

Nhiệt độ (0C)

Một chu kỳ 30 50

15 95

Bảng 3. Chu kỳ nhiệt cho tổng hợp gen và các cặp mồi

Cặp mồi Chu kỳ Bƣớc Thời gian

(giây)

Nhiệt độ (0C)

AIV matrix 45 Biến tính 1 94 H7 40 Bám của cặp mồi 20 60 Biến tính 1 94 Bám của cặp mồi 20 58 H5 40 Biến tính 1 94 Bám của cặp mồi 20 57 Kéo dài chuỗi tổng hợp 5 72

(Chú ý: Màu huỳnh quang được xác định ở bước bám gắn của cặp mồi).

Phản ứng RTRT - PCR đƣợc tiến hành với những thành phần sau cùng với cặp mồi và chu kỳ thích hợp. Khởi động phản ứng với các ống phản ứng đƣợc đặt trong giá đựng ống lạnh và dùng các đầu pipet có lọc.

-Các bƣớc tiến hành phản ứng PCR:

Bƣớc 1: Trộn dung dịch Master mix (MM) tùy theo lƣợng mẫu thí nghiệm. Số lƣợng thành phần dung dịch MM trên một mẫu bệnh phẩm là:

Rw (nƣớc tinh khiết): 5,5 µl. 2X (nguyên liệu): 12,5 µl.

PPP (probe, primer xuôi và ngƣợc): 1,5 µl. E (enzyme): 0,5 µl.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn

bằng máy rung Votex.

- Cho 25 µl mẫu đối chứng vào ống đối chứng dƣơng. Cho 25 µl nƣớc