giải các hợp chất hữu cơ
Sau khi tuyển chọn được 10 chủng vi khuẩn Bacillus tiến hành nghiên cứu khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ của các chủng. Tiến hành nuôi cấy và xác định khả năng sinh enzyme bằng phương pháp đục lỗ thạch. Kết quả thu được vòng thủy phân xung quanh lỗ thạch (Bảng 3.2). Các chủng này có khả năng phân giải hợp các hợp chất hữu cơ nhờ sinh tổng hợp cellulase, amylase và pectinase. Tuy nhiên, đường kính vịng thủy phân chỉ có tính chất định tính, do đó 5 chủng cho đường kính vịng phân giải lớn nhất từ 25 – 32 mm được sử dụng để tiếp tục nghiên cứu.
Bảng 3.2 Đường kính vịng phân giải của Enzyme ngoại bào
STT Enzyme
Chủng
Cellulase Amylase Pectinase
CMC (mm) Tinh bột (mm) Pectin (mm) 1 T1 25±0,1 25±0,6 21±0,2 2 T2 25±0,3 27±0,5 26±0,3 3 T3 19±0,2 16±0,2 15±0,5 4 T4 25±0,5 25±0,1 23±0,0 5 T5 26±0,1 20±0,2 15±0,6 6 T6 21±0,2 25±0,3 22±0,2 7 CP7 25±0,7 27±0,5 24±0,1 8 CP8 27±0,4 28±0,3 24±0,2 9 CP9 22±0,1 21±0,4 25±0,7 10 CP10 32±0,0 27±0,2 25±0,5
Qua bảng 3.2 trên cho thấy, các chủng đều có khả năng sinh enzyme amylase, pectinase, cellulose. Trong đó, đường kính phân giải ở mơi trường
40
cellulase lớn hơn. Có 5 chủng có đường kính vịng phân giải là lớn nhất đạt từ 23 – 32mm: T2; T4; CP7; CP8; CP10 đủ tiêu chuẩn tiếp tục nghiên cứu tiếp,
các chủng T3; T5 cho đường kính vịng phân giải là nhỏ nhất đạt từ 15 – 26mm. Hoạt tính phân giải cellulose các chủng trong nghiên cứu này cao hơn so với một số kết quả nghiên cứu của một số nhóm tác giả khác khi nghiên cứu về vi khuẩn thủy phân cellulose. Trong nghiên cứu của Võ Văn Phước Quệ và Cao
Ngọc Điệp năm 2011, khi phân lập vi khuẩn phân giải cellulose trong đất trồng
lúa và dạ cỏ bị, nhóm tác giả đã phân lập được 4 dịng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme cellulase ngoại bào (Võ Văn Phước Quệ và Cao Ngọc Điệp, 2014). Kết quả đánh giá khả năng sinh enzyme endoglucanases bằng cơ chất
CMC (1%) đạt 19,44 -25,43mm. Ngoài ra, các chủng phân lập trong nghiên cứu của Behera và đồng tác giả (2013) khi phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose ở vùng đất ngập mặn ở Ấn Độ (Behera et al., 2014) cũng có hoạt tính thủy phân cellulose rất cao. 15 chủng báo cáo trong nghiên cứu này có hoạt tính cellulase dao động trong khoảng 2,471 to 98,253mm. Hiện nay, báo cáo về khả năng thủy phân cellulose cao của các chủng vi khuẩn có thể kể đến chủng
Bacillus cereus trong nghiên cứu của Mukesh Kuma và cộng sự, chủng này có
hoạt tính cellulase lên đến 102mm trong 48 giờ (Mukesh Kuma et al.,2012).
Theo những nghiên cứu trước đây về khả năng sinh cellulase của vi khuẩn,
Bacillus là một trong những chi có khả năng phân hủy cellulose cao nhất. Một
số chủng được quan tâm nhiều nhất như B. subtilis (Park et al., 1991), B.
pumilus (Padaria et al., 2014), Bacillus sp. KMS-330 (Ozaki, Ito 1991),
Bacillus megaterium (Shakoor, 2013).
Enzyme amylase
Sau 24 giờ ủ, vòng sáng xung quanh khuẩn lạc (hay còn gọi là vịng halo) xuất hiện. Vịng halo có thể nhận rõ hơn và đo được khi làm tràn mẫu với dung dịch Iod. Phần môi trường chứa tinh bột chưa bị thủy phân bởi enzyme amylase sẽ cho màu tím xanh với dung dịch Iod, riêng vùng sáng là do tinh bột đã bị thủy phân do đó khơng cho phản ứng màu với Iod. Tuy nhiên, đường kính vịng
41
halo giữa các dòng vi khuẩn khác nhau tùy thuộc vào loài vi khuẩn và khả năng thủy phân tinh bột. Kết quả quan sát này phù hợp với kết quả nghiên cứu của
Sasmita Mishra và Niranjan Behera (2008) và Sekar Sudharhsan et al. (2007).
Theo các tác giả này thì các khuẩn lạc có khả năng phân hủy tinh bột (Amylase) tạo ra một vòng sáng rộng xung quanh khuẩn lạc và vịng sáng này khơng cho phản ứng màu với dung dịch Iod. Sự hiện diện của vòng halo thủy phân tinh bột bao quanh khuẩn lạc có thể sử dụng để đánh giá sơ bộ khả năng thủy phân tinh bột của các dòng vi khuẩn.
Enzyme pectinase
Kết quả bảng 3.2 cho thấy các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cơ chất pectin (vịng phân giải đạt đường kính khá lớn từ 15 – 26mm). Đối với công bố về pectinase của một số tác giả như: Tripathi, pectinase thu được từ chủng
Bacillus subtilis có vịng phân giải 7,8mm (Tripathi G.D và cs, 2014) hay trong
công bố của tác giả Kumar, pectinase từ chủng cocci sp đạt 23,5mm (Kumar A. và cs, 2012) thì chủng vi khuẩn phân lập được có khả năng phân giải pectinase khá cao.
42
Chủng T4 Chủng T8
Hình 3.2 Ảnh vịng phân giải của enzyme vi khuẩn
3.1.3. Kết quả tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng phân
giải P khó tan
Kết quả cho thấy cả 5 chủng đều có khả năng tạo các vòng phân giải phospho trên môi trường Pikovskaya chứa Ca3(PO4)2 khó tan. Hiện tượng tạo vòng phân giải photpho được giải thích là do các chủng này có khả năng tiết một số dạng axit hữu cơ như acid citric, acid lactic, acid gluconic, acid succinic... làm giảm pH của môi trường nuôi cấy nên giúp vi khuẩn phân giải được photpho khó tan. Đường kính vịng phân giải trong bảng 3.3 sau:
Bảng 3.3 Đường kính vịng phân giải Ca3(PO4)2
Ký hiệu Khả năng phân giải P khó tan D_đường kính vịng
phân giải(mm)
d_đường kính khuẩn lạc(mm)
Hoạt tính phân giải (D/d) T2 80,5±0,09 7 11,5 T4 37,5±0,05 7 5,4 CP7 26±0,1 7 3,7 CP8 45±0,3 7 6,4 CP10 62±0,2 7 8,9
43
Qua bảng trên cho thấy các chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng phân
giải phosphat khó tan là khác nhau. 2 chủng cho kết quả tốt nhất là T2 và CP10 với đường kính vịng phân giải lần lượt là 11,5 và 8,9. Chủng vi khuẩn CP7 cho kết quả phân giải thấp nhất là 3,7. Từ đó cho thấy các chủng này có thể sử dụng nhân rộng để có thể bổ sung vào các chế phẩm yêu cầu về khả năng phân giải P khó tan.
Chủng T2 Chủng T4 Chủng CP7
Chủng CP8
44
Hình 3.3 Hình ảnh vịng phân giải Ca3(PO4)2