Bacillus
Bảng 3.8 cho thấy môi trường LB* là mơi trường thích hợp nhất cho sự tăng trưởng của chủng Bacillus CP10 với sinh khối đạt 18,08g/l, gấp 2,7 lần so với môi trường LB. Đây cũng là môi trường cơ bản được lựa chọn trong các nghiên cứu chọn điều kiện nuôi cấy Bacillus (Han và cs, 2014; Monteiro và cs,
2014). Khi thay thế peptone thành tryptone trong hai môi trường LB và PCA,
giá trị sinh khối thu được đều lớn hơn mức ý nghĩa là 0,05. Việc thay thế peptone bằng tryptone giúp giảm chi phí sản xuất do giá thành của peptone cao hơn so với của tryptone.
Bảng 3.8 Kết quả lựa chọn môi trường cơ bản, tỷ lệ cấp giống, nhiệt độ, pH tới sinh khối chủng Bacillus
Môi trường cơ bản (điều kiện: 30oC, pH 7, 120 v/p, 10% giống, nuôi cấy 72 giờ)
Môi trường LB LB* NB PCA PCA*
Sinh khối (g/l)
6,50±0,5 18,08±0,2 14,85±0,1 13,37±0,0 12,87±0,7
Tỷ lệ giống (điều kiện: môi trường LB*, 30oC, pH 7, 120 v/p, nuôi cấy 72 giờ)
% (v/v) 1 3 5 7 9
Sinh khối (g/l)
13,84±0,3 16,57±0,1 18,02±0,6 16,75±0,2 15,61±0,1
Thời gian lên men (môi trường LB*, 30oC, pH 7, tỷ lệ cấp giống 5%, 120 v/p)
49
Giờ 24 48 72 96 120
Sinh khối (g/l)
12,64±0,4 15,77±0,5 18,92±0,1 16,99±0,4 14,95±0,1
Nhiệt độ (môi trường LB*, pH 7, tỷ lệ cấp giống 5%, 120 v/p, nuôi cấy trong 72 giờ)
oC 30 35 37 40 42
Sinh khối (g/l)
13,89±0,2 15,64±0,6 17,5±0,8 15,42±0,1 14,31±0,3
pH ((môi trường LB*, 37 oC, pH 7, tỷ lệ cấp giống 5%, 120 v/p, nuôi cấy trong 72 giờ) pH 6 6,5 7 7,5 8 Sinh khối (g/l) 9,83±0,4 14,77±0,7 18,86±0,0 15,43±0,2 9,70±0,5 Lựa chọn tỷ lệ cấp giống
Bảng 3.8 cho thấy, tỷ lệ cấp giống 5%, tương đương 5,1 × 108 CFU/mL, cho sinh khối chủng Bacillus CP10 cao nhất là 18,02g/l. Nếu tăng tỷ lệ giống lên trên 9% thì sau 72 giờ sinh khối giảm đi đáng kể. Nguyên nhân có thể do khi mật độ giống ban đầu quá cao thì các chất đinh dưỡng trong môi trường nhanh chóng bị cạn kiệt trước khi vi sinh vật đạt được tốc độ tăng sinh tối đa. Các tỷ lệ tiếp giống 1%, 3% và 7% cho thấy khơng có sự sai khác ở mức ý nghĩa 0,05 về giá trị sinh khối.
Lựa chọn thời gian lên men
Thời gian lên men là một trong những thông số được các nhà sản xuất quan tâm hang đầu vì nó liên quan trực tiếp tới q trình vận hành máy móc, thiết bị và nhân công. Trong hầu hết các nghiên cứu lựa chọn thời gian sinh trưởng thích hợp, các chủng Bacillus đều được lên men trong khoảng thời gian từ 48-72h (Sreekumar, Krishman, 2010; Han et al., 2014; Nguyen, Nguyen, 2014) để đảm bảo cho sinh khối thu được với tỷ lệ cao là các tế bào sinh dưỡng
50
và giảm dần khi kéo dài thời gian lên men tới 96h nhưng khơng có sự sai khác ở mức ý nghĩa 0,05. Chủng Bacillus CP10 có khả năng sinh bào tử để trở về trạng thái tiềm sinh nên khi kéo dài thời gian nuôi cấy, môi trường dinh dưỡng bị cạn kiệt thì chủng vẫn giữ được một mức ổn định nhất định về mật độ tế bào, đây cũng là một trong những ưu thế lớn của các chủng Bacillus
trong ứng dụng sản xuất phân bón hữu cơ.
Lựa chọn nhiệt độ lên men
Kết quả nghiên cứu trên đồ thị hình 3.8 cho thấy chủng Bacillus CP10 có khả năng tạo sinh khối thấp ở nhiệt độ 30 oC và 42 oC, ở các nhiệt độ 35 oC; 37 oC, 40 oC, sự hình thành sinh khối cao nhất dao động trong khoảng 15,42 – 17,5 g/l. Tại nhiệt độ 37 oC sự tạo thành sinh khối đạt giá trị lớn nhất 17,5 tại thời điểm 96 giờ lên men. Sự ảnh hưởng của nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng của vi khuẩn CP10, do vậy tác động trực tiếp lên sự hình thành sinh khối. Chủng vi khuẩn Bacillus CP10 sinh trưởng tốt ở khoảng nhiệt độ từ 34- 41oC phù hợp với thân nhiệt của đa số vật nuôi cũng là một lợi thế khi chọn làm chế phẩm phân bón hữu cơ.
Lựa chọn giá trị pH
Giá trị pH ban đầu ảnh hưởng đáng kể đến sự sinh trưởng của tế bào vi sinh vật, mỗi một loại vi sinh vật đều có một mơi trường pH thích hợp cho q trình sinh trưởng.Theo nhiều nghiên cứu đã cơng bố, chủng Bacillus thường sinh trưởng và tạo sinh khối ở giá trị pH từ 6 đến 8 (Sreekumar, Krishman, 2010). Sự ảnh hưởng của pH đến sự phát triển và sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus
CP10 thể hiện rất rõ tại các giá trị pH = 6 ở môi trường axit yếu và pH =8 môi trường kiềm, khả năng tạo sinh khối rất thấp.Sự tạo sinh khối mạnh trong khoảng pH từ 7 đến 8 trong thời gian 72 giờ. Giá trị sinh khối lớn nhất (18,86g/l) tại thời điểm 72h trong mơi trường có pH ban đầu là 7.
51
Bảng 3.9 Kết quả lựa chọn nồng độ tinh bột, peptone, cao nấm men tới sự tăng sinh khối của chủng vi khuẩn Bacillus
Nồng độ Cao Nấm Men ( điều kiện: 5g/l NaCl, 5% giống, pH 7, 37oC, 120 v/p, nuôi cấy sau 72 giờ)
(g/l) 4 5 6 7 8
Sinh khối (g/l)
14,01 ±0,1 16,87 ±0,4 18,35 ±0,6 15,54 ±0,3 12,89 ±0,2
Nồng độ peptone (điều kiện: 5g/l NaCl, 5% giống, pH 7, 37oC, 120 v/p, nuôi cấy sau 72 giờ)
(g/l) 3 4 5 6 7
Sinh khối (g/l)
13,81±0,4 15,35 ±0,3 18,3±0,1 17,5±0,6 15,55 ±0,2
Lựa chọn nồng độ Cao nấm men
Qua bảng 3.9 cho thấy rằng, khi tăng hàm lượng Cao Nấm Men từ 4g/l đến 6g/l thì sinh khối của vi khuẩn Bacillus cũng tăng và hàm lượng Cao Nấm Men tối ưu là 6g/l với sinh khối đạt cực đại là 18,35g/l. Khi tiếp tục tăng hàm lượng CNM lên 7 và 8g/l thì sinh khối vi khuẩn có xu hướng giảm ( 12,89g/l), điều này có thể giải thích khi nồng độ CNM quá thấp hoặc quá cao sẽ ảnh hưởng tới tính thấm và áp suất thẩm thấu của tế bào, do đó khơng thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn. Như vậy, hàm lượng CNM 6g/l thì sự phát triển của vi khuẩn Bacillus CP10 phát triển tốt nhất và được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
Lựa chọn nồng độ Peptone
Peptone là nguồn nitrogen thích hợp nhất cho sự tăng trưởng của chủng Bacillus CP10 trong các nguồn nitrogen sử dụng để khảo sát có nồng độ 5g/l cho giá trị sinh khối là lớn nhất 18,06g/l. Nguồn nitrogen đóng vai trò cung cấp cơ chất để vi khuẩn tổng hợp nên các hợp chất chứa nitrogen cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng. Mỗi loài vi khuẩn khác nhau sẽ thích hợp với tỉ lệ C/N trong môi trường sống nhất định (Yu et al., 1998; Carvalho et al., 2010). Do đó nguồn nitrogen bổ sung vào môi trường
52