CH NGă2 .ăT HC NGH IM
2.2. NI DUNG NGHIÊN CU
đápă ngăđ c m cătiêuăđ t ra, n i dung nghiên c u s bao g m:
− Chu n b cao chi t, ti năhƠnhănơngăcaoăhƠmăl ng mangiferin t cao chi t.
− ánhăgiáătínhăch t cao chi t, ch ph m lá dó b u và mangiferin tinh khi t.
− Nghiên c u t o h phân tán cao chi t lá dó b u, h phân tán ch ph m lá dó b u và h phân tán mangiferin.
− ánh giá tính ch t, đ hịa tan và ho t tính sinh h c c a các h huy n phù.
− Th nghi măđ a các h phân tán v d ng b t s y phun.
22
2.3. NGUYÊN LI U VÀ THI T B S D NG 2.3.1. Nguyên li u
Ngun li u chính bao g m lá dó b uăđ c thu ho ch vào tháng 11 t i Bình
Ph c. Sauăđó,ăláădóăb u đ c ti n x lý b ng cách r a s ch, lo i b lá b nh, sâu r y và ph iăkhôđ chu n b choăgiaiăđo n x lý ti p theo.
Mangiferin 95% đ c mua t cơng ty Shaanxi Yuantai Biological Technology Co., Ltd.
2.3.2. Hóa ch t
B ng 2.1. Hóa ch t s d ng và ngu n g c
STT Tên hóa ch t Ngu n g c
1 Acid gallic c 2 AlCl3 c 3 C2H5OH 98% Vi t Nam 4 CH3CN Vi t Nam 5 CH3COOK c 6 CH3OH Vi t Nam 7 H3PO4 Vi t Nam 8 HCl Trung Qu c 9 KH2PO4 Trung Qu c 10 Maltodextrin Pháp 11 Na2CO3 Trung Qu c 12 NaCl Vi t Nam 13 NaOH Trung Qu c 14 N c c t Vi t Nam 15 Thu c th Folin-Ciocalteau c
23
2.3.3. Thi t b
B ng 2.2. Các d ng c và thi t b s d ng
D ng c Thi t b
Bình c u và b y cô quay Cân 4 s Satorius CPA224S
Cánh khu y Máy cô quay chân không
Nhi t k Thi t b l c chân không
Erlene B p gia nhi t
C c thu tinh B siêu âm
Bìnhăđ nh m c Máyăđoăđ m Satorius MA35
ng nh gi t MáyăđoăUV-Vis Helios Epsilon
Cuvette Máy l c
Micro pipette Máyăđ ng hóa FJ ậ 200
Pipette Thi t b LDS Horiba LA ậ 950V2
Burette Máyăđ ng hóa t căđ cao FSH-2A
Ph u l c Máy đoăSEMăJSM-IT100ăInTouchScope™
L th y tinh Máyăđo pH Lab 850 Schott Instrument
u l c syringe 0,45 m MáyăđoămƠuăKonica Minolta CR ậ 400 Máy s y phun LabPlant SD ậ 05
Thi t b HPLC Agilent 1260 Infinity
2.4. PH NGăPHÁPăNGHIÊNăC U
2.4.1. ánhăgiá tính ch t ngo i quan c a m u 2.4.1.1. Xácăđ nhăđ m
m c a m u đ căxácăđ nh b ngămáyăđoăđ m Satorius MA35 t i Phịng thí nghi m B mơn H uăc .ăM tăl ng m u v aăđ đ c tr iăđ u trên m tăđ aănhômă vƠăđ căđ t vào bu ng m uăđ ti năhƠnhăđo. m c a m u s đ c tính d a trên s chênh l ch kh iăl ng gi a m uăbanăđ u và m u khô sau khiăđưălo i b hoàn toàn m
24
b ngăph ngăphápănhi t. Ti năhƠnhăđoăđ m 3 l n và l y giá tr trung bình. Giá tr
đ măđ c tính theo cơng th c:
(1)
Trongăđóμă μăđ m trung bình c a nguyên li u (%) n: s l năđo
μăđ m c a nguyên li u t i l n thí nghi m th i (%)
2.4.1.2. Xácăđnh màu s c
Các thông s màu s c c a m uăđ căđoătheoăph ngăphápăđoăph n x b m t d a trên không gian màu CIE LCh b ng máy Konica Minolta CR ậ 400 t i phịng thí nghi m B mơn H uăc .ăH th ngăđ năv đ c s d ng bao g m:
• Tr c L đ cătr ngăcho đ sáng c a màu s c,ăđ c th hi n t mƠuăđenătuy t
đ iă(L=0)ăđ n màu tr ng tuy tăđ i (L=100).
• Tr căCăđ i di năchoăđ bão hịa màu, có giá tr thayăđ i t 0% (màu xám)
t ngă ng v trí hồn tồn khơng bão hịa đ n 100%.
• Tr căhăđ i di n cho s c màu và đ c bi u di n trên vòng tròn màu theo chi u
ng c chi uăkimăđ ng h , t ngă ng t góc 0o (mƠuăđ ) sang 90o (màu vàng), 180o (màu xanh l c)ăđ n 270o (mƠuăxanhăd ng)ăvƠăquayăl i 0o.
d ng dung d ch, m u s đ c ch a trong cuvette còn d ng b t thì m u đ c
đ t vào gi a 2 lam kính thu tinh.ă tăđ u dị lên b m t cuvet hay lam kính có ch a m u, ti n hành đoă3ăl n và l y k t qu trung bình. S bi n thiên màu s căđ c tính
b ng cơng th c sau: (2)
E s cho bi t kho ng cách hình h c c a hai màu trong m t h th ng.
2.4.2. nhăl ng các ho t ch t trong m u
2.4.2.1. Xácăđnh hàm l ng mangiferin b ng ph ngăphápăs c ký l ng hi u n ngăcaoă(HPLC)
Thi t b s c kí l ng hi uăn ngăcaoă(HPLC) Agilent 1260 Infinity theo mơ hình s căkíăphaăđ o đ c s d ng đ xácăđ nhăhƠmăl ng mangiferin.
25
B ng 2.3. Thi t b và thông s thi t l p HPLC
Th tích tiêm m u 5ă L
C tăphaăt nh C18 (150 mmì4,6 mm, 5 àm) Nhi t c t 28 oC
Phaăđ ng
Dung dchăn c pH 3,0 và acetonitrile v i t l 85:15 (v/v).
N c s d ngăcóăpHă3,0ăđ căđi u ch nh b ng dung d ch acid orthophosphoric.
T căđ dòng 0,9 mL/phút
u dò Diod array detector (DAD) t iăb c sóng 256 nm
Chu n b : Các d ng c ch a m u ph iăđ c r a s ch và ngâm trong EtOH trong 24 gi nh m tránh l n t p ch t. DungămôiădùngălƠmăphaăđ ngăđ c kh b t kho ng 15 phút trong b siêuăơmătr c khi s d ng. Các dung d ch ch t chu n, dung d ch m u
đ c l c b ngăđ u l că450ănmătr c khi đ c tiêm vào máy HPLC.
Xây d ngăđ ng chu n: Hòa tan ch t chu n mangiferin (5 mg) b ng 50 mL MeOH
thuăđ c dung d ch g c. Dung dchăsauăđóăđ c pha lỗng thành các n ngăđ t ngă
ng 5, 10, 15, 20, 25, 30 ppm b ng dung môi MeOH. M i n ngăđ đ c chu n b 3 m u (n=3). Ti năhƠnhăđoăm u b ngăph ngăphápăHPLCăd a trên các thông s thi t
l p B ng 2.3.
oăm u: Ti n hành chu n b và th c hi n m uăt ngăt nh ăch t chu n. HƠmăl ng
xanthoneăđ căxácăđ nhătheoăph ngătrìnhăđ ng chu nănh ăsauμ
S = 20,835C ậ 5,4843 R2 = 0,9999 (3)
Trongăđóμă C ậ N ngăđ mangiferin trong m u (ppm) S ậ Di n tích peak (mAU.s)
26
2.4.2.2. Xácăđ nhăhƠmăl ng xanthone b ng ph n ng t o ph c v i AlCl3 (UV- Vis)
Thu c th AlCl3 t o ph c b n v i C-4 nhóm ketone, C-3 và C-5 nhóm hydroxyl c a flavon và flavonol t o thành ph cămƠuăxanhăláăđ cătr ngăcóăđ h p thu c căđ i t i 410 nm. Ngoài ra, AlCl3 còn t o ra ph c acid không b n v i nhóm ortho- dihydroxyl g n trên vịng A- và B- đ cătr ngăc a nhóm flavonoids.
Chu n b :
Các d ng c thí nghi m ti p xúc v i dung d ch ph n ngăđ c r a s ch và ngâm trong dung d ch EDTA 5% trong 24 gi tr c ph n ng.
Thu c th AlCl3 10% (m/v): Hòa tan 1 g AlCl3 khanătrongă10ămLăn c c t. Dung d ch potassium acetate 0,03 M: Hòa tan 294 mg b t potassium acetate
khanătrongă100ămLăn c c t.
Xây d ngăđ ng chu n:
Dung d ch chu n mangiferin n ngăđ 2000 µg/mL: Hịa tan 20 mg mangiferin trong 10 mL EtOHăthuăđ c dung d ch g c. Sauăđó,ăti n hành pha các dung d ch chu n có n ngăđ t ngă ng 20, 40, 60, 80, 100 µg/mL. M i n ngăđ đ c chu n b 3 m u (n=3).
Thêm l năl t 1,5 mL EtOH và 0,1 mL thu c th AlCl3 10% vào 0,5 mL dung d ch mangiferin các n ngăđ khácănhauăđưăđnh s n. Sau 5 phút, thêm 3 mL dung d ch potassium acetate 0,03M vào dung d ch trên. yên ph n ng nhi tăđ phịng
trongă30ăphút,ăsauăđóăđoăđ h p thu b c sóng 410 nm.
oăm u: Ti n hành chu n b dung d ch m u và th c hi n ph n ngăt ngăt nh ăch t chu n.ăHƠmăl ngăxanthoneăđ căxácăđ nhătheoăph ngătrìnhăđ ng chu nănh ăsauμă
A = 0,0024C + 0,0026 R2 = 0,9941 (4)
Trongăđóμă C ậ N ngăđ xanthone trong m u (ppm) A ậ h p thu t iăb c sóng 410 nm.
27
2.4.2.3. Xácăđ nhăhƠmăl ng polyphenol b ng ph n ng màu Folin-Ciocalteu
Ph ngăphápăxácăđ nhăhƠmăl ng polyphenol d a trên ph n ng kh h n h p heteropolyphosphotungsat ậ molypdat b ng h p ch tăphenolătrongămôiătr ng ki m t o ra dung dchămƠuăxanhălamăcóăđ h p thu c căđ i b c sóng 760 nm. oăđ h p thu b c sóng 760 nm k t h păđ th đ ng chu n v i ch t chu n là acid gallic s
tínhăđ c hàmăl ng các h p ch t phenolic có trong m u phân tích. Qătrìnhăđ c th c hi n d aătrênăph ngăphápăTCVNăλ745ăậ 1:2013.
Xây d ngăđ ng chu n:
Dung d ch chu n acid gallic n ngăđ 1000 µg/mL: Hịa tan 0,1 g acid gallic khan vƠăđ nh m căđ n 100 mL. Dùng pipet chuy n các th tích dung d ch chu n acid gallic và pha loãng thành các n ngăđ t ngă ng 10, 20, 30, 40, 50 µg/mL, m i n ng
đ ba m u (n=3).
Cho 2,500 mL thu c th Folin ậ Ciocalteau 10% vào 0,5 mL dung d ch acid gallic các n ngăđ khácănhauăđưăđ nh s n,ăđ ng nh t b ng b l c siêu âm trong 5 phút nhi tăđ phòng. H n h pătrênăđ c thêm 2 mL dung d ch Na2CO3 7,5%, sau
đóăchoăph n ng nhi tăđ phòng trong 60 phút và ti năhƠnhăđoăm tăđ quang b c
sóngă ă=ă760ănm.ă
oăm u: Chu n b dung d ch m u và th c hi n ph n ngăt ngăt nh ăch t chu n.
HƠmăl ng polyphenol đ căxácăđ nhătheoăph ngătrìnhăđ ng chu nănh ăsauμă
A = 0,0085C + 0,0312 R2 = 0,9946 (5)
Trongăđóμă C ậ N ngăđ polyphenol trong m u (ppm) A ậ h p thu t iăb c sóng 760 nm.
2.4.3. Phân tích hìnhătháiăvƠăkíchăth c h t nano
2.4.3.1. Xácăđnh phân b kíchăth c h t b ngăph ngăphápăLDS
Kíchăth c trung bình và s phân b kíchăth c h t c a h phơnătánăđ c xác
đnh b ng thi t b ph nhi u x laser LDS (Laser diffraction spectrometry) Horiba LA ậ 950V2 t i Phịng thí nghi m B mơn H uăc .ăH th ng s d ng 2 ngu n sáng
28
đ ki m soát s t ngătácăc a m u v i ánh sáng, trong đóădiodeăphátăquangămƠuăxanhă dịăđ c các h t nh đ năkíchăth c 0,01 µm và tia laser mƠuăđ có th dịăđ c các h tăcóăkíchăth căđ n 3 mm.
Khi ch y qua chùm tia laser, do s chuy năđ ng ng u nhiên c a các h t trong h phơnătánăvƠăkíchăth c khác nhau c a chúng mà ánh sáng s vaăđ p v i các h t và tán x cácăgócăđ khác nhau. D aăvƠoăđó,ăkíchăth c h t trung bình s đ c tính tốn theo thuy t Mie.
2.4.3.2. Xácăđnh hình thái h t b ngăph ngăphápăSEM
Kính hi năviăđi n t quét SEM (Scanning Electron Microscope) có th t o ra hình nh c a b m t v t m u v iăđ phân gi i cao b ng cách s d ng m t chùm đi n t n ngăl ng cao quét trên b m t m u. Vi c t o ra hình nh này đ c th c hi n thơng qua q trình ghi nh n và phân tích các b c x phát ra t t ngătácăc a chùm
đi n t v i b m t m u v t. Hình thái h tănanoăđ căxácăđnh trên máy đoăSEM t i
Tr ngă i h c Qu c t - i h c Qu c gia Thành ph H Chí Minh.
2.4.4. ánhăgiáăho t tính kháng oxy hóa b ngăph ngăphápăABTS
Ph ngăphápăTEACăhayăph ngăphápă2,2’ă- azinobis (3 ậ ethylbenzthiazoline - 6 - sulfonic acid) (ABTS) d a trên vi c b t các g c t do ABTS b ng các ch t kháng oxy hóa có trong m u. G c ABTS+ th ng có màu xanh l c đ n màu xanh ng c v i giá tr h p th c căđ i 645 nm, 734 nm và 815 nm. Các h p ch t kháng
oxyăhóaătrongămơiătr ng ph n ng s b t các g c t do d n t i m tămƠuăvƠădoăđóă
làm gi măđ h păthu,ăt ngă ng v i n ngăđ ch t kháng oxy hóa hi n di n. Ho t tính
khángăoxyăhóaăđ căxácăđ nhăkhiăđoăđ h p thu t iăb c sóng 734 nm v i ch tăđ i ch ng là ascorbic acid (vitamin C).
Sàng l c kho ng n ngăđ c ch :
M uăđ c phân tán trong dung d chăđ m phosphate pH = 7,4 thành các n ngăđ
th nghi m 100, 10, 1 ppm.
ABTSăđ căhòaătanătrongăn c v i n ngăđ 7 mM và đ c tr n v i dung d ch kali persulfate (K2S2O8) 2,45 mM theo t l 1:1 (v/v). Sauăđó,ăti n hành dung d ch
29
trong bóng t i nhi tăđ phòng trong kho ng 12 ậ 16 gi tr c khi s d ng. Pha loãng dung d ch này b ngăđ măđ năđ h p thu OD734 = 0,7 ± 0,02 tr c khi th c hi n ph n ng.
• M uăđo ch a 2.000 Lădungăd chăg căt ădo và 1.000 Lădungăd chăm uă ă n ngăđ ăth ănghi m.
• M uăđ iăch ngăch a 2.000ă Lădungăd chăg căt ădovƠă1.000ă Lădungăd chă
ascorbic acid 0,6 mg/mL.
• M uătr ngăch a2.000ă Lădungăd chăg căt ădovƠă1.000ă Lădungăd chăđ mă
pH 7,4.
H năh păđ c l căđ u,ăđ ăyênăchoăph nă ngă ănhi tăđ ăphòngătrongă30ăphútăr i ti năhƠnhăđoăđ ăh păthu.
− Xácăđnh giá tr IC50:
T k t qu kh o sát m u các n ngăđ th nghi m, ti n hành thí nghi măt ng
t v i các n ngăđ phù h p. M i n ngăđ m uăđ c th c hi n ít nh t 3 l năđ tính giá tr trung bình. Ph nătr mă c ch g c t doăđ c tính theo cơng th c sau:
Q AA x
Trongăđóμ Aμăđ h p thu c a dung d ch ch a m u th Aoμăđ h p thu c a dung d ch ch a m u tr ng
Giá tr IC50 đ că xácă đ nh t đ ng cong bi u di n m i quan h gi a n ng đ
và ph nătr mă c ch (%Q).
2.4.5. ánhăgiáăđ hòa tan
Ph ngăphápăđánhăgiáăđ hòaătanăđ c ti năhƠnhăt ngăt đ căquyăđnh trong
D căđi n Vi t Nam IV t iăcácămôiătr ng pH khác nhau.
Chu n b các dung dch đ m:
Dung d chăđ m pH 1,2: Hòa tan 11,7 g NaCl trong 85 mL dung d ch HCl 1 N,
30
Dung dchăđ m pH 4,5: Hòa tan 13,6 g KH2PO4 trongă1.500ămLăn c c t, sau
đóăti năhƠnhăđi u ch nh pH b ng dung d ch HCl 1 N ho c NaOH 1 N (n u c n) và
đnh m căđ n 2.000 mL b ngăn c c t.
Dung d chăđ m pH 6,8: Hòa tan 13,6 g KH2PO4 trong 45 mL dung d ch NaOH
1ăNăvƠăđ nh m căđ n 2.000 mL b ngăn c c t.
Chu n b m u: Hút chính xác 5 mL huy n phù b ng pipette và pha loãng b ng
dung d chăđ m trong erlen,ăsauăđóăti n hành thí nghi m cácăđi u ki n sau:
• Thi t b : Máy l c
• Mơiătr ng: 45 mL dung dchăđ m
• pHămơiătr ng: 1,2; 4,5; 6,8
• Nhi tăđ : (37 ± 0,5) ºC
• T căđ l c: 150 vịng/phút
Sau các kho ng th i gian l năl t 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90 và 120 phút, d ng quá trình phân tán và ti n hành l y m u đ xácăđ nhăđ hòa tan. Dùng pipette l y m u kho ng gi a l p dung d chăđ m r i l c qua màng l că0,45ă m, sauăđóăti n hành xác
đnh hƠmăl ng mangiferin trong m uă(theoăph ngăphápăUV-Vis) (Ph n 2.4.2.2)
d aătrênăph ngătrìnhăđ ng chu nănh ăsauμ
• Mơiătr ng pH 1,2: A = 0,0025C + 0,0617 R2 = 0,9926 (7)
• Mơiătr ng pH 4,5: A= 0,0026C + 0,176 R2 = 0,9864 (8)
• Mơiătr ng pH 6,8: A = 0,0021C + 0,071 R2 = 0,9970 (9)
Trongăđóμă C ậ N ngăđ polyphenol trong m u (ppm) A ậ h p thu t iăb c sóng 760 nm.
Kh n nghịaătanăđ c tính theo cơng th c: (10)
Trongăđóμ ậ hịa tan t iăđi m th i (%)
ậ L ng ch t hòa tan t i th iăđi m th i (mg)
31
Các m uăđ i chi uăđ c s d ngăđ so sánh quá trình gi i phóng ho t ch t. V
đ ngăcongăđ ng h c q trình gi i phóng ho t ch t theo các m c th iăgianăt ngă
ng.
2.5. N I DUNG TH C NGHI M 2.5.1. Chu năb ăvƠăđánhăgiáănguyênăli u 2.5.1. Chu năb ăvƠăđánhăgiáănguyênăli u
Quy trình chu n b cao chi t và ch ph m đ c th hi n trong Hình 2.1.
Hình 2.1. Qui trình đi u ch cao chi t và ch ph m
Lá dó b u sau khi thu ho chăđ c r a s ch đ lo i b t p ch t, sauăđóăti n hành s y khơ b ng khơng khí nóng 50oC choăđ năkhiăđ m trong nguyên li u th păh nă
32
12%. Nghi n lá dó b u khơăđ năđ m n t 1 ậ2ămmăvƠăl uătr trong túi kín kèm gói silica gel hút m, không ti p xúc v i ánh sáng m t tr i tr c ti p.
B t lá dó b u ti p t căđ c chi t nóng v i ethanol 60o, m i m u 50 g b t khô
đ c chi t 3 l n, m i l n 1 gi t i nhi tăđ 70 oC. T l gi a kh iăl ng b t khô và th tíchădungămơiăđ c s d ngălƠă1μ10ă(g/mL).ăSauăđó,ăth c hi n l c chân không thu
đ c d ch chi t ethanol và bã. Tồn b d chătríchălyăđ c cô quay áp su tăkémăđ lo i b dung môi. Cao chi t đ c b o qu n l nhătrongăđi u ki năkínăkhíăđ t ngăth i gian
l uătr . Hi u su t thu cao t ngăđ c tính theo cơng th c:
(11)
Trongăđóμă Hμăhi uăsu tăthuăcaoăt ngă(%)
μăkh iăl ngăcaoăthuăđ căsauăqătrìnhăchi tă(g) μăkh iăl ngănguyênăli uăkhôăđemăchi tă(g)
Ti p t c th c hi n quá trìnhănơngăcaoăhƠmăl ng mangiferin trong cao chi t d a trên ph ngăphápăh p ph - r a gi i. Nh a h p ph HDP300 đ c ho t hóa b ng cách ngâm 24 gi trong ethanol 98% và r a l i b ngăn c c t nhi u l nătr c khi s