CH NGă2 .ăT HC NGH IM
2.4.2. nhăl ng các hot cht trong mu
2.4.2.1. Xácăđnh hàm l ng mangiferin b ng ph ngăphápăs c ký l ng hi u n ngăcaoă(HPLC)
Thi t b s c kí l ng hi uăn ngăcaoă(HPLC) Agilent 1260 Infinity theo mơ hình s căkíăphaăđ o đ c s d ng đ xácăđ nhăhƠmăl ng mangiferin.
25
B ng 2.3. Thi t b và thông s thi t l p HPLC
Th tích tiêm m u 5ă L
C tăphaăt nh C18 (150 mmì4,6 mm, 5 àm) Nhi t c t 28 oC
Phaăđ ng
Dung dchăn c pH 3,0 và acetonitrile v i t l 85:15 (v/v).
N c s d ngăcóăpHă3,0ăđ căđi u ch nh b ng dung d ch acid orthophosphoric.
T căđ dòng 0,9 mL/phút
u dò Diod array detector (DAD) t iăb c sóng 256 nm
Chu n b : Các d ng c ch a m u ph iăđ c r a s ch và ngâm trong EtOH trong 24 gi nh m tránh l n t p ch t. DungămôiădùngălƠmăphaăđ ngăđ c kh b t kho ng 15 phút trong b siêuăơmătr c khi s d ng. Các dung d ch ch t chu n, dung d ch m u
đ c l c b ngăđ u l că450ănmătr c khi đ c tiêm vào máy HPLC.
Xây d ngăđ ng chu n: Hòa tan ch t chu n mangiferin (5 mg) b ng 50 mL MeOH
thuăđ c dung d ch g c. Dung dchăsauăđóăđ c pha lỗng thành các n ngăđ t ngă
ng 5, 10, 15, 20, 25, 30 ppm b ng dung môi MeOH. M i n ngăđ đ c chu n b 3 m u (n=3). Ti năhƠnhăđoăm u b ngăph ngăphápăHPLCăd a trên các thông s thi t
l p B ng 2.3.
oăm u: Ti n hành chu n b và th c hi n m uăt ngăt nh ăch t chu n. HƠmăl ng
xanthoneăđ căxácăđ nhătheoăph ngătrìnhăđ ng chu nănh ăsauμ
S = 20,835C ậ 5,4843 R2 = 0,9999 (3)
Trongăđóμă C ậ N ngăđ mangiferin trong m u (ppm) S ậ Di n tích peak (mAU.s)
26
2.4.2.2. Xácăđ nhăhƠmăl ng xanthone b ng ph n ng t o ph c v i AlCl3 (UV- Vis)
Thu c th AlCl3 t o ph c b n v i C-4 nhóm ketone, C-3 và C-5 nhóm hydroxyl c a flavon và flavonol t o thành ph cămƠuăxanhăláăđ cătr ngăcóăđ h p thu c căđ i t i 410 nm. Ngồi ra, AlCl3 cịn t o ra ph c acid khơng b n v i nhóm ortho- dihydroxyl g n trên vòng A- và B- đ cătr ngăc a nhóm flavonoids.
Chu n b :
Các d ng c thí nghi m ti p xúc v i dung d ch ph n ngăđ c r a s ch và ngâm trong dung d ch EDTA 5% trong 24 gi tr c ph n ng.
Thu c th AlCl3 10% (m/v): Hòa tan 1 g AlCl3 khanătrongă10ămLăn c c t. Dung d ch potassium acetate 0,03 M: Hòa tan 294 mg b t potassium acetate
khanătrongă100ămLăn c c t.
Xây d ngăđ ng chu n:
Dung d ch chu n mangiferin n ngăđ 2000 µg/mL: Hịa tan 20 mg mangiferin trong 10 mL EtOHăthuăđ c dung d ch g c. Sauăđó,ăti n hành pha các dung d ch chu n có n ngăđ t ngă ng 20, 40, 60, 80, 100 µg/mL. M i n ngăđ đ c chu n b 3 m u (n=3).
Thêm l năl t 1,5 mL EtOH và 0,1 mL thu c th AlCl3 10% vào 0,5 mL dung d ch mangiferin các n ngăđ khácănhauăđưăđnh s n. Sau 5 phút, thêm 3 mL dung d ch potassium acetate 0,03M vào dung d ch trên. yên ph n ng nhi tăđ phịng
trongă30ăphút,ăsauăđóăđoăđ h p thu b c sóng 410 nm.
oăm u: Ti n hành chu n b dung d ch m u và th c hi n ph n ngăt ngăt nh ăch t chu n.ăHƠmăl ngăxanthoneăđ căxácăđ nhătheoăph ngătrìnhăđ ng chu nănh ăsauμă
A = 0,0024C + 0,0026 R2 = 0,9941 (4)
Trongăđóμă C ậ N ngăđ xanthone trong m u (ppm) A ậ h p thu t iăb c sóng 410 nm.
27
2.4.2.3. Xácăđ nhăhƠmăl ng polyphenol b ng ph n ng màu Folin-Ciocalteu
Ph ngăphápăxácăđ nhăhƠmăl ng polyphenol d a trên ph n ng kh h n h p heteropolyphosphotungsat ậ molypdat b ng h p ch tăphenolătrongămôiătr ng ki m t o ra dung dchămƠuăxanhălamăcóăđ h p thu c căđ i b c sóng 760 nm. oăđ h p thu b c sóng 760 nm k t h păđ th đ ng chu n v i ch t chu n là acid gallic s
tínhăđ c hàmăl ng các h p ch t phenolic có trong m u phân tích. Qătrìnhăđ c th c hi n d aătrênăph ngăphápăTCVNăλ745ăậ 1:2013.
Xây d ngăđ ng chu n:
Dung d ch chu n acid gallic n ngăđ 1000 µg/mL: Hịa tan 0,1 g acid gallic khan vƠăđ nh m căđ n 100 mL. Dùng pipet chuy n các th tích dung d ch chu n acid gallic và pha loãng thành các n ngăđ t ngă ng 10, 20, 30, 40, 50 µg/mL, m i n ng
đ ba m u (n=3).
Cho 2,500 mL thu c th Folin ậ Ciocalteau 10% vào 0,5 mL dung d ch acid gallic các n ngăđ khácănhauăđưăđ nh s n,ăđ ng nh t b ng b l c siêu âm trong 5 phút nhi tăđ phòng. H n h pătrênăđ c thêm 2 mL dung d ch Na2CO3 7,5%, sau
đóăchoăph n ng nhi tăđ phòng trong 60 phút và ti năhƠnhăđoăm tăđ quang b c
sóngă ă=ă760ănm.ă
oăm u: Chu n b dung d ch m u và th c hi n ph n ngăt ngăt nh ăch t chu n.
HƠmăl ng polyphenol đ căxácăđ nhătheoăph ngătrìnhăđ ng chu nănh ăsauμă
A = 0,0085C + 0,0312 R2 = 0,9946 (5)
Trongăđóμă C ậ N ngăđ polyphenol trong m u (ppm) A ậ h p thu t iăb c sóng 760 nm.
2.4.3. Phân tích hìnhătháiăvƠăkíchăth c h t nano
2.4.3.1. Xácăđnh phân b kíchăth c h t b ngăph ngăphápăLDS
Kíchăth c trung bình và s phân b kíchăth c h t c a h phơnătánăđ c xác
đnh b ng thi t b ph nhi u x laser LDS (Laser diffraction spectrometry) Horiba LA ậ 950V2 t i Phịng thí nghi m B mơn H uăc .ăH th ng s d ng 2 ngu n sáng
28
đ ki m soát s t ngătácăc a m u v i ánh sáng, trong đóădiodeăphátăquangămƠuăxanhă dịăđ c các h t nh đ năkíchăth c 0,01 µm và tia laser mƠuăđ có th dịăđ c các h tăcóăkíchăth căđ n 3 mm.
Khi ch y qua chùm tia laser, do s chuy năđ ng ng u nhiên c a các h t trong h phơnătánăvƠăkíchăth c khác nhau c a chúng mà ánh sáng s vaăđ p v i các h t và tán x cácăgócăđ khác nhau. D aăvƠoăđó,ăkíchăth c h t trung bình s đ c tính tốn theo thuy t Mie.
2.4.3.2. Xácăđnh hình thái h t b ngăph ngăphápăSEM
Kính hi năviăđi n t quét SEM (Scanning Electron Microscope) có th t o ra hình nh c a b m t v t m u v iăđ phân gi i cao b ng cách s d ng m t chùm đi n t n ngăl ng cao quét trên b m t m u. Vi c t o ra hình nh này đ c th c hi n thơng qua q trình ghi nh n và phân tích các b c x phát ra t t ngătácăc a chùm
đi n t v i b m t m u v t. Hình thái h tănanoăđ căxácăđnh trên máy đoăSEM t i
Tr ngă i h c Qu c t - i h c Qu c gia Thành ph H Chí Minh.
2.4.4. ánhăgiáăho t tính kháng oxy hóa b ngăph ngăphápăABTS
Ph ngăphápăTEACăhayăph ngăphápă2,2’ă- azinobis (3 ậ ethylbenzthiazoline - 6 - sulfonic acid) (ABTS) d a trên vi c b t các g c t do ABTS b ng các ch t kháng oxy hóa có trong m u. G c ABTS+ th ng có màu xanh l c đ n màu xanh ng c v i giá tr h p th c căđ i 645 nm, 734 nm và 815 nm. Các h p ch t kháng
oxyăhóaătrongămơiătr ng ph n ng s b t các g c t do d n t i m tămƠuăvƠădoăđóă
làm gi măđ h păthu,ăt ngă ng v i n ngăđ ch t kháng oxy hóa hi n di n. Ho t tính
khángăoxyăhóaăđ căxácăđ nhăkhiăđoăđ h p thu t iăb c sóng 734 nm v i ch tăđ i ch ng là ascorbic acid (vitamin C).
Sàng l c kho ng n ngăđ c ch :
M uăđ c phân tán trong dung d chăđ m phosphate pH = 7,4 thành các n ngăđ
th nghi m 100, 10, 1 ppm.
ABTSăđ căhòaătanătrongăn c v i n ngăđ 7 mM và đ c tr n v i dung d ch kali persulfate (K2S2O8) 2,45 mM theo t l 1:1 (v/v). Sauăđó,ăti n hành dung d ch
29
trong bóng t i nhi tăđ phịng trong kho ng 12 ậ 16 gi tr c khi s d ng. Pha loãng dung d ch này b ngăđ măđ năđ h p thu OD734 = 0,7 ± 0,02 tr c khi th c hi n ph n ng.
• M uăđo ch a 2.000 Lădungăd chăg căt ădo và 1.000 Lădungăd chăm uă ă n ngăđ ăth ănghi m.
• M uăđ iăch ngăch a 2.000ă Lădungăd chăg căt ădovƠă1.000ă Lădungăd chă
ascorbic acid 0,6 mg/mL.
• M uătr ngăch a2.000ă Lădungăd chăg căt ădovƠă1.000ă Lădungăd chăđ mă
pH 7,4.
H năh păđ c l căđ u,ăđ ăyênăchoăph nă ngă ănhi tăđ ăphòngătrongă30ăphútăr i ti năhƠnhăđoăđ ăh păthu.
− Xácăđnh giá tr IC50:
T k t qu kh o sát m u các n ngăđ th nghi m, ti n hành thí nghi măt ng
t v i các n ngăđ phù h p. M i n ngăđ m uăđ c th c hi n ít nh t 3 l năđ tính giá tr trung bình. Ph nătr mă c ch g c t doăđ c tính theo cơng th c sau:
Q AA x
Trongăđóμ Aμăđ h p thu c a dung d ch ch a m u th Aoμăđ h p thu c a dung d ch ch a m u tr ng
Giá tr IC50 đ că xácă đ nh t đ ng cong bi u di n m i quan h gi a n ng đ
và ph nătr mă c ch (%Q).
2.4.5. ánhăgiáăđ hòa tan
Ph ngăphápăđánhăgiáăđ hòaătanăđ c ti năhƠnhăt ngăt đ căquyăđnh trong
D căđi n Vi t Nam IV t iăcácămôiătr ng pH khác nhau.
Chu n b các dung dch đ m:
Dung d chăđ m pH 1,2: Hòa tan 11,7 g NaCl trong 85 mL dung d ch HCl 1 N,
30
Dung dchăđ m pH 4,5: Hòa tan 13,6 g KH2PO4 trongă1.500ămLăn c c t, sau
đóăti năhƠnhăđi u ch nh pH b ng dung d ch HCl 1 N ho c NaOH 1 N (n u c n) và
đnh m căđ n 2.000 mL b ngăn c c t.
Dung d chăđ m pH 6,8: Hòa tan 13,6 g KH2PO4 trong 45 mL dung d ch NaOH
1ăNăvƠăđ nh m căđ n 2.000 mL b ngăn c c t.
Chu n b m u: Hút chính xác 5 mL huy n phù b ng pipette và pha loãng b ng
dung d chăđ m trong erlen,ăsauăđóăti n hành thí nghi m cácăđi u ki n sau:
• Thi t b : Máy l c
• Mơiătr ng: 45 mL dung dchăđ m
• pHămơiătr ng: 1,2; 4,5; 6,8
• Nhi tăđ : (37 ± 0,5) ºC
• T căđ l c: 150 vòng/phút
Sau các kho ng th i gian l năl t 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90 và 120 phút, d ng quá trình phân tán và ti n hành l y m u đ xácăđ nhăđ hòa tan. Dùng pipette l y m u kho ng gi a l p dung d chăđ m r i l c qua màng l că0,45ă m, sauăđóăti n hành xác
đnh hƠmăl ng mangiferin trong m uă(theoăph ngăphápăUV-Vis) (Ph n 2.4.2.2)
d aătrênăph ngătrìnhăđ ng chu nănh ăsauμ
• Mơiătr ng pH 1,2: A = 0,0025C + 0,0617 R2 = 0,9926 (7)
• Mơiătr ng pH 4,5: A= 0,0026C + 0,176 R2 = 0,9864 (8)
• Mơiătr ng pH 6,8: A = 0,0021C + 0,071 R2 = 0,9970 (9)
Trongăđóμă C ậ N ngăđ polyphenol trong m u (ppm) A ậ h p thu t iăb c sóng 760 nm.
Kh n nghịaătanăđ c tính theo cơng th c: (10)
Trongăđóμ ậ hịa tan t iăđi m th i (%)
ậ L ng ch t hòa tan t i th iăđi m th i (mg)
31
Các m uăđ i chi uăđ c s d ngăđ so sánh q trình gi i phóng ho t ch t. V
đ ngăcongăđ ng h c q trình gi i phóng ho t ch t theo các m c th iăgianăt ngă
ng.
2.5. N I DUNG TH C NGHI M 2.5.1. Chu năb ăvƠăđánhăgiáănguyênăli u 2.5.1. Chu năb ăvƠăđánhăgiáănguyênăli u
Quy trình chu n b cao chi t và ch ph m đ c th hi n trong Hình 2.1.
Hình 2.1. Qui trình đi u ch cao chi t và ch ph m
Lá dó b u sau khi thu ho chăđ c r a s ch đ lo i b t p ch t, sauăđóăti n hành s y khơ b ng khơng khí nóng 50oC choăđ năkhiăđ m trong nguyên li u th păh nă
32
12%. Nghi n lá dó b u khơăđ năđ m n t 1 ậ2ămmăvƠăl uătr trong túi kín kèm gói silica gel hút m, không ti p xúc v i ánh sáng m t tr i tr c ti p.
B t lá dó b u ti p t căđ c chi t nóng v i ethanol 60o, m i m u 50 g b t khô
đ c chi t 3 l n, m i l n 1 gi t i nhi tăđ 70 oC. T l gi a kh iăl ng b t khô và th tíchădungămơiăđ c s d ngălƠă1μ10ă(g/mL).ăSauăđó,ăth c hi n l c chân không thu
đ c d ch chi t ethanol và bã. Tồn b d chătríchălyăđ c cơ quay áp su tăkémăđ lo i b dung môi. Cao chi t đ c b o qu n l nhătrongăđi u ki năkínăkhíăđ t ngăth i gian
l uătr . Hi u su t thu cao t ngăđ c tính theo cơng th c:
(11)
Trongăđóμă Hμăhi uăsu tăthuăcaoăt ngă(%)
μăkh iăl ngăcaoăthuăđ căsauăqătrìnhăchi tă(g) μăkh iăl ngăngunăli uăkhơăđemăchi tă(g)
Ti p t c th c hi n quá trìnhănơngăcaoăhƠmăl ng mangiferin trong cao chi t d a trên ph ngăphápăh p ph - r a gi i. Nh a h p ph HDP300 đ c ho t hóa b ng cách ngâm 24 gi trong ethanol 98% và r a l i b ngăn c c t nhi u l nătr c khi s d ng.ăSauăđó,ăchoănh a h p ph vào erlene ch a d ch m u n ngăđ 20 g/L, b t kín mi ng bình đ tránhăbayăh iădungămơi. Erlene đ c l c v i t căđ 150 rpm nhi t
đ phòng trong th i gian 3 gi . Sau quá trình h p ph , h n h p nh a đ c tách ra kh i erleneăđ ti n hành n p c t (ø12mm×150mm). Tr c tiên, dùngăn c c t r a c t
đ lo i b t p ch t cịn sót l i trên h n h p nh a. Sauăđó, ti n hành r a gi i 3 l n b ng dung môi ethanol 60o, m i l n s d ng 6 mL dung môi. i u ki n h p ph - r a gi i
đ c tóm t t trong B ng 2.4. Hi u su t h p ph và r a gi iăđ c tính theo cơng th c:
Hi u su t h p ph (%) = x 100 (12)
Hi u su t r a gi i (%) = x 100 (13)
Trongăđóμă : hàm l ngămangiferinătrongăd chătr căh păph ă(mg)
: hàm l ngămangiferinătrongăd chăsauăh păph ă(mg)
33
B ng 2.4. i u ki n th c hi n quá trình h p ph - r a gi i b ng nh a h p ph
Quá trình h p ph Quá trình r a gi i
Kh iăl ng nh a 3 g N ngăđ ethanol r a gi i 60o
N ngăđ d ch m u 20 g/L T căđ r a gi i 2 mL/phút
T căđ l c 150 rpm S l n r a gi i 3 l n
Th i gian 3 gi Th tích dung mơi r a gi i 6 mL/l n
Ti p t c cô quay lo i b dung môi d ch r a gi iăthuăđ c b t ch ph m có hàm
l ngămangiferinăcaoăh nănhi u sao v i cao chi tăbanăđ u.
Ti năhƠnhăđánhăgiáătínhăch t ngo i quan, đ ng th i ki m tra hƠmăl ng ho t
ch t mang ho t tính sinh h c (polyphenol, xanthone, mangiferin) (m c 2.4.2) và
kh n ngăkhángăoxyăhóaăb ngăph ng pháp ABTS (m c 2.4.4) c a c 3 nguyên
li u: cao chi t, ch ph m lá dó b u và mangiferin.
2.5.2. Nghiênăc uăquiătrìnht oăh ăphơnătán
Ti n hành nghiên c uăđi u ki n thích h păđ t o các h phân tán, bao g m:
• H phân tán cao chi t lá dó b u
• H phân tán ch ph m lá dó b u
• H phân tán mangiferin t th tr ng
S d ng ph ngăphápăđ ng hóa t căđ cao rotor ậstatorăđ đ aăm u v kích
th c nh . Các h kh o sát đ c phơnătánătrongăn c d i s có m t c a ch t ho t
đ ng b m t.ăSauăđó,ăti n hành q trình đ ng hóa b ngămáyăđ ng hóa FSH-2A.
34
Các y u t hƠmăl ng ch t ho tăđ ng b m tăđ c s d ng, th i gian, t căđ đ ng hóa và n ngăđ m u s d ng s tácăđ ngăđ năkíchăth c h tăphơnătánăc ngănh ă đ b n h . Vì v y,ăchúngăđ c kh o sát luân phiên đ đánhăgiáăkh n ngă nhăh ng
đ năkíchăth c c a các h huy n phù.
• i v i h phân tán cao chi t:
Kh o sát nh h ng c a lo i ho t đ ng b m t: Th c hi n quá trình t o h phân tán cao chi t n ngăđ 2ăg/Lăd i s h tr c a m t s lo iăH BMăbao g m lecithin, tween 80, SLS v i t l cao chi tμăH BMălƠă1μ1ă(g/g),ăth i gian và t căđ đ ng hóa l năl t là 12.000 rpm và 15 phút. Lo iăH BMăcó kh n ngăh tr gi măkíchăth c h t t, đ m b oăđ b n c a h theo th i gian và phù h p v iăđ nhăh ng c aăđ tài s
đ c l a ch n c đnh cho t t c các kh o sát ti p theo trên c 3ăđ iăt ng.
Kh o sát nh h ng c a t l cao chi t và ch t H BM s d ng: Sau khi ch n
đ c ch t H BM thích h p, ti n hành kh o sát t l cao chi t vƠăH BMătrongăkho ng
1μ0,5ăg/găđ n 1:5 g/g v i hàm m c tiêu là thuăđ c h có kíchăth c nh vƠăđ đ ng
đ u h t t.
Kh o sát nh h ng c a th i gian đ ng hóa: Ti n hành đánhăgiáăvƠăl a ch n th iăgianăđ ng hóa t iă u nh t cho qui trình (trong kho ng 5 ậ 30 phút).
Kh o sát nh h ng c a t c đ đ ng hóa: T căđ đ ngăhóaăđ c t ngăd n t 10.000 rpmălênăđ n 13.000 rpm b ng thi t b đ ng hóa FSH-2A đ đánhăgiáăkh n ngă
nhăh ngăđ n tính ch t c a h phân tán cao chi t.
Th nghi m gia t ng n ng đ cao chi t: Gi nguyên các thông s đưăđ c l a ch n, th c hi năthayăđ i n ngăđ cao chi t trong h phân tán t 2 g/L l năl t lên 5