CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.7 Nghiên cứu thực vật học và nhân giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế
1.7.1 Nghiên cứu thực vật học và nhân giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên
thế giới và ở Việt Nam
1.7.1 Nghiên cứu thực vật học và nhân giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế giới thế giới
17.1.1 Nghiên cứu thực vật học lan Hoàng thảo (Dendrobium)
a) Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học lan Dendrobium
Shi-Jian Yang et al., (2016) nghiên cứu đặc điểm giải phẫu, tỷ lệ mất nước, sinh lý của lá và giả hành của bốn lồi Dendrobium trong việc duy trì sự cân bằng nước. Kết quả cho thấy loài D. chrysotoxum và D. officinale có tỷ lệ mất nước thấp hơn,
lớp biểu bì trên của lá dày hơn, nhưng độ dày lớp biểu bì thấp hơn. Cịn hai lồi D.
chrysanthum và D. crystallinum có lớp cutin mỏng hơn và tỷ lệ mất nước cao hơn,
mật độ tế bào ít hơn và hàm lượng nước bão hịa cao hơn trong giả hành. Do đó, hai lồi D. chrysanthum và D. crystallinum có thể chống lại khô hạn bằng cách trữ nước trong các giả hành để bù cho lớp cutin mỏng và nước nhanh mất qua lá. Tương tự, trong điều kiện phịng thí nghiệm, giả hành mang lá bị cắt tỉa có tỷ lệ thốt nước thấp hơn so với các mẫu chỉ cắt lá. Điều này có nghĩa là hoa lan phụ sinh sử dụng hai phương thức khác nhau để duy trì cân bằng nước: lớp biểu bì dày để giữ nước ở lá và trữ nước trong giả hành. Kết quả cho thấy loài Dendrobium sp. với lớp biểu bì mỏng thường có giả hành với khả năng lưu trữ nước cao để bù đắp cho tốc độ mất nước nhanh hơn.
Metusala et al., (2017) đã nghiên cứu vi phẫu lá và thân của hai lồi Dendrobium từ mơi trường sống khác nhau liên quan đến khả năng thích ứng của chúng với điều kiện khơ hạn. Lồi D. capra được biết đến là một lồi thích nghi với mơi trường sống rừng khơ, nơi mà hầu hết cây rụng lá vào mùa hè, trong khi D. arcuatum thích nghi với rừng ẩm. So với D. arcuatum, đặc điểm giải phẫu của lan D. capra cho thấy thích nghi với điều kiện khơ hạn hơn. Lan D. capra có lớp cutin, lớp biểu bì, lớp dưới biểu bì và thịt lá dày hơn, bó mạch chính rộng hơn, mơ cứng phát triển, mật độ khí khổng thấp hơn, lớp tế bào biểu bì cao hơn.
Những kết quả này là cơ sở giúp các nhà trồng lan về cách thức sử dụng nước thích hợp cho lồi lan Hồng thảo, có lợi cho việc bảo tồn và ni trồng hoa lan và
cũng là cơ sở để đưa ra các chế độ tưới nước, các loại phân bón và giá thể phù hợp cho lan Hồng thảo nói chung và hai lồi lan Nghệ tâm và Hạc vỹ nói riêng.
b) Nghiên cứu một số thành phần hóa sinh của chi lan Hồng thảo (Dendrobium)
Chi Hoàng thảo (Dendrobium) được biết trong các bộ phận của cây có chứa một số hoạt chất như: phenol, alkaloids, coumarin, tecpen, flavonoids và polysaccharides…(Sunita Shailajan et al., 2015). Polysaccharides từ chi Hồng thảo có chức năng điều hịa miễn dịch, chống oxy hố và hoạt động bảo vệ gan; alkaloids chống đục thủy tinh thể và bảo vệ thần kinh, các hợp chất thơm và sesquiterpenoid có hoạt tính chống tạo mạch, chống khối u và tác dụng chống biến chứng,…(Jun Xu, 2015).
Theo nghiên cứu của y học cổ truyền và y học hiện đại cho thấy, nhiều lồi thuộc chi Hồng thảo có tác dụng tốt cho sức khỏe con người: làm thuốc bổ, thúc đẩy việc sản xuất các chất dịch cơ thể, có lợi cho dạ dày, kéo dài tuổi thọ, chống lão hóa, giảm đau, hạ sốt, chống viêm, chống sự kết tụ tiểu cầu, bảo vệ gan, chống chứng xơ hóa, chống virút, trị nấm, kháng khuẩn, chất chống oxy hóa, điều trị bệnh tiểu đường, bảo vệ thần kinh, điều hòa miễn dịch và chống ung thư,...(Veronika Cakova et al., 2017). Các hợp chất khác nhau được xác định từ D. nobile có khả năng kháng u và chống gây đột biến. Các alkaloids như: dendramine, nobilonine, erianin và phenanthrene có khả năng chống khối u ác tính được phân lập từ D. nobile, chất gigantol trong D. ovatum rất hiệu quả trong chữa bệnh đau dạ dày, bài tiết mật và cũng được sử dụng
như thuốc nhuận tràng. Lan D. tokai được sử dụng làm thuốc tránh thai ở Ấn Độ.
Trong hầu hết các loài của chi Dendrobium, các flavonoids chính là quercetin và
kaempferol. Erianin và chrysotoxine được phân lập từ D. chrysotoxum, thường được sử dụng hạ sốt và thuốc giảm đau trong y học cổ truyền Trung Quốc. Một số hợp chất (gigantol, moscatilin, homoeriodictyol, scoparone, scopoletin) được phân lập từ D. densiflorum có tác dụng chống kết tụ tiểu cầu (Jaime TeixeiradaSilva, 2013a).
Lan D. speciosum đã được sử dụng như một loại lương thực chống đói khẩn cấp. Lan D. teratifolium và D. discolor đã được sử dụng như một vị thuốc để điều trị bệnh lỵ, giảm đau và trị nấm ngoài da (Bijaya Pant, 2013).
thư dạ dày và ung thư phổi, chất chống đông máu (Tsai et al., 2010), điều trị bệnh
tiểu đường type 2 (Zhang et al., 2011). Trong lan Nghệ tâm có chứa shihunine, 9,10 dihydrophenanthrene 2,4,7 triol, moscatin, loddigesiinols C, moscatilin, gigantol và tristin (Li Chunyan et al., 2013).
Theo nghiên cứu của Ho Kyung Jung et al., (2015) chất chiết xuất từ lan Nghệ tâm có hiệu quả ức chế melanin, ức chế hoạt động tyrosinase và phát triển dendrite, có tác dụng làm trắng da.
Theo Caimei Gu et al., (2017) trong lan Nghệ tâm có polysaccharides (14,923%), alkaloids (0,109 %), bibenzyn gigatol (0,08973%). Veronika Cakova et al., (2017)
cho rằng moscatilin trong Nghệ tâm có tác dụng ngăn ngừa tế bào ung thư tuyến giáp, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư thực quản, ung thư tuyến tụy. Loddigessinol G-J, Crepidatuol B có tác dụng điều trị bệnh tiểu đường.
Gần đây nhất, Huiping Chen et al., (2018) sử dụng phương pháp sắc ký, xác định được trong Nghệ tâm có diglucoside, flifimdioside A (1), một alkaloids dạng imidazolium, anosmine (4).
Lan Hạc vỹ (D. aphyllum) được coi là một loại cây thuốc quý, trong số các “Thần nông thảo dược” và được xếp vào loại sản phẩm cao cấp có tác dụng bổ âm thanh nhiệt, tạo nước bọt có lợi cho dạ dày, bổ phế và giảm ho. Bằng phương pháp phân tích quang phổ, các nhà khoa học đã chứng minh các polysaccharides (đường đa) AP là Acetylglucose - O, chứa liên kết β (l-›4), dạng vòng của mỗi chất cặn thủy phân có dạng tháp trong đó các mạch chính được cấu tạo bởi D-manose và D-glucose. Các thí nghiệm lâm sàng tiến hành trên động vật cho thấy AP có hoạt tính tổng hợp chất miễn dịch tốt (Zhao Yong-Ling et al., 1994).
Zhang, (2008) đã xác định được trong thân lan Hạc vỹ có chứa: moscatilin, gigantol, batatasin, tristin, moscatin, hircinol, salidroside và p-hydroxylbenzylacetic acid. Veronika Cakova et al., (2017) cho rằng ngồi polysaccharides cịn có các hợp chất phenol như moscatin, moscatilin và tricetin 3', 4', 5'-trimetyl ete 7-O-- glucopyranoside, ức chế sản xuất NO, có hoạt động điều hịa miễn dịch.
Các chất chống oxy hoá peptide được chiết xuất từ Hạc vỹ (D. aphyllum) bao gồm superoxidedismutase, catalase và glutathione peroxidase. Các axit amin: Ala,
Val, Ile, Leu, Tyr, Phe, Try, Pro, Met và Cys chỉ ra rằng peptit DA-P có hàm lượng chất dinh dưỡng cao và có hoạt động chống oxy hoá tối ưu (Huifan Liu et al., 2017).
Từ các nghiên cứu trên cho thấy rất cần thiết phải nhân giống hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ phục vụ cho sức khỏe con người cũng như bảo tồn nguồn gen quý.
1.7.1.2 Nghiên cứu về nhân giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế giới
a) Nghiên cứu về nhân giống in vitro
- Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân giống
Nền môi trường nuôi cấy với nồng độ và tỷ lệ khác nhau của các nguyên tố khống đa, vi lượng, vitamin...có ảnh hưởng rất rõ đến kết quả nuôi cấy in vitro cây lan. Dutta et al., (2011) đã sử dụng hạt của Hạc vỹ 15 tuần tuổi được nảy mầm trên môi trường MS. Hạt giống hình thành protocorm sau 5 tuần nuôi cấy. Các PLBs cho tỷ lệ nảy mầm, số chồi và rễ nhiều hơn trên môi trường MS bổ sung IAA + KIN.
Mohammad Musharof Hossain et al., (2013) nghiên cứu nhân giống lan Hạc vỹ lại cho rằng trên môi trường Phytamax (Sigma) + 1 mg/l BA cho tỷ lệ hạt nảy mầm; hệ số nhân protocorm đạt cao hơn khi bổ sung thêm 1 mg/l αNAA vào môi trường nuôi cấy.
Sagaya Mary and Divakar (2015), nghiên cứu trên ba loại môi trường VW, B5 và KC cho gieo hạt in vitro với lan D. macrostachyum, môi trường VW + 0,5 mg/l BAP + 5 mg/l αNAA là phù hợp nhất cho sự hình thành cây con. Mơi trường VW +1,5 mg/l BAP + 1,5 mg/l αNAA + 50 ml/l sữa dừa + 500 mg/l THT phù hợp cho tạo rễ cây in vitro.
Đối với loài lan D. jerdonianum Wight, Sagaya Mary et al., (2016) cho rằng mơi trường MS thích hợp cho ni cấy từ hoa. Môi trường KC phù hợp với nuôi cấy từ lá. Môi trường VW phù hợp với nuôi cấy từ đốt thân.
- Ảnh hưởng của nguồn các bon hữu cơ đến kết quả nhân in vitro
Ảnh hưởng của nguồn các bon hữu cơ đến nuôi cấy in vitro cây lan đã được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu. Theo Ferreira et al., (2011) trên loài Dendrobium
Second Love ở các giai đoạn khác nhau thì thích hợp với các nồng độ sucrose khác nhau, số rễ hình thành nhiều khi sucrose ở hàm lượng 60 g/l, ở nồng độ 20 g/l thuận lợi cho nhân chồi và ở 40 g/l chiều dài rễ phát triển cao nhất.
Tapash Kumar Bhowmik et al., (2017) sử dụng 3 loại carbohydrate khác nhau, sucrose, glucose và lactose thúc đẩy sự nảy mầm của loài D. palpebra, kết quả cho thấy sử dụng 20 g/l sucrose thích hợp nhất cho sự nảy mầm của hạt trên môi trường Phytamax (PM).
- Ảnh hưởng của các hỗn hợp chất hữu cơ tự nhiên đến kết quả nhân giống in vitro
Trong nuôi cấy in vitro cây lan, hàng loạt các tác giả trong và ngoài nước đã
nghiên cứu sâu về ảnh hưởng của các hỗn hợp chất hữu cơ tự nhiên đến sự sinh trưởng phát triển của mẫu cấy. Dịch nghiền cà chua thường được bổ sung vào môi trường vi nhân giống hoa lan và có hiệu quả với một số lồi lan như: D. noblie (Soares et al., 2013). Nước ép cà chua và nước dứa 15% cho thấy tỷ lệ nảy mầm tốt nhất đối với gieo hạt in vitro lan D. ovatum (Willd.) (Thejaswini and Narasimhan, 2017).
Trên đối tượng D. lasianthera, bổ sung 2 g/l peptone trong môi trường VW đã được chứng minh là hàm lượng thích hợp cho sự nảy mầm của hạt (100%) và sự hình thành chồi với sự phát triển của protocorm lên tới 84%. Bổ sung 15% nước dừa đã cải thiện hiệu quả sự phát triển của chồi, rễ và lá đều phát triển tốt (Edy Setiti WidaUtami et al., 2017).
- Ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng thực vật đến kết quả nhân giống in
vitro
Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đã được nhiều tác giả quan tâm. Lu Wenyun et al., (2004) đã nghiên cứu nhân giống lan Nghệ tâm (D. loddigesii) cho kết quả: mơi trường khởi động thích hợp nhất: MS + 0,1 mg/l αNAA +
1 mg/l BA, môi trường nhân nhanh phù hợp: MS + 0,1 mg/l αNAA + 3,0 mg/l BA, mơi trường tạo cây hồn chỉnh ½ MS + 0,7 mg/l αNAA. Bai et al., (2004) đã nuôi cấy các đoạn thân mang mầm ngủ của Nghệ tâm (D. loddigesii) ghi nhận rằng môi trường khởi động thích hợp nhất MS + 0,3 - 0,9 mg/l BA + 0,1 - 0,3 mg/l αNAA. Môi trường nhân nhanh MS + 0,9 mg/l BA + 0,2 mg/l αNAA, pH 5.8.
Dake Zhao et al, (2013) nghiên cứu nhân giống và tạo hoa trong ống nghiệm loài lan D. wangliangii, các tác giả tiền xử lý 1 mg/l GA3 trong 15 ngày, sau đó cấy trên mơi trường ½ MS + 2 mg/l BA + 0,1 mg/l αNAA + 100 ml/l sữa dừa, tỷ lệ protocorms
tăng lên 54,68%. Ngoài ra, sự tạo cảm ứng cây ra hoa (100%) trên môi trường bổ sung 2 mg/l TDZ và sự phát triển hoa tốt nhất khi bổ sung 0,3 mg/l paclobutrazol (PP333) và 0,5 mg/l αNAA.
Xin Qian et al, (2014) nghiên cứu khảo sát sản xuất hoa và hạt giống của loài lan
D. officinate. Calluses đã được tạo ra từ các đỉnh chồi trên môi trường MS bổ sung
0,2 mg/l BA + 0,05 mg/l αNAA. Nhiều chồi được tái sinh từ các mẫu PLBs khi cấy môi trường MS + 1 mg/l αNAA. Các cây con in vitro cao 2 - 4 cm, duy trì được sẽ ra hoa với tỷ lệ cao nhất 83,2% và hoa bình thường 73,6% khi được ni cấy trên mơi trường MS + 15% nước dừa + 0,1 mg/l TDZ trong 9 tuần. Phân tích các mơ cho thấy hoa có hình thái bình thường so với giống gốc.
Kanjana Juntada et al., (2015) tạo phôi soma từ protocorm và lá của lồi D. Sonia ‘Earsakul’ trên mơi trường ½ MS + (0,1; 0,3 và 1 mg/l TDZ) hoặc kết hợp 0,1 mg/l αNAA hoặc 1 mg/l (2,4-D) khơng có sự khác biệt đáng kể trong tỷ lệ tạo phôi soma từ PLBs đạt (38,18 - 49%). Tỷ lệ tạo phôi soma từ lá đạt cao nhất là (18,75%).
Abdul Aziz Mirani et al., (2017b) đã nghiên cứu bổ sung αNAA và IBA vào môi trường nuôi cấy lan D. nobile. Kết quả ghi nhận với nồng độ ở 3 mg/l αNAA cây in
vitro cho số lượng rễ nhiều hơn và rễ dài hơn so với IBA. Tuy nhiên, khi sử dụng
IBA ở nồng độ 1mg/l cũng có tác dụng rất hiệu quả cho q trình ra rễ in vitro lan D.
nobile, khi tăng nồng độ IBA lên quá 1 mg/l sự tạo thành rễ bị ức chế.
Saranjeet Kaur, (2017) nuôi cấy cắt lát mỏng ngang thân cây con in vitro lan D.
chrysotoxum (chiều dày 2 mm), các mẫu cấy trên môi trường cấy trên môi trường MS
bổ sung cytokinin (1 mg/l BA, 1 mg/l KIN) riêng lẻ hoặc kết hợp auxin (1 mg/l αNAA) cho tỷ lệ hình thành (PLBs) và tái sinh chồi cao trên cả môi trường lỏng và đặc. Cây con phát triển tốt trên môi trường MS + 50 g/l dịch chuối nghiền nát.
Paromik Bhattacharyya et al., (2018) nhân giống lan D. aphyllum từ các lớp tế
bào lát mỏng cắt ngang (t-TCL). Trên mơi trường MS + 15 µM meta-topolin + 10
µM TDZ + 10 µM AgNO3 thích hợp cho sự phát triển của chồi sau 8 tuần ni cấy đạt 39,41 chồi/mẫu cấy. Trên mơi trường ½ MS + 15 µM IBA cho tỷ lệ tạo rễ cao nhất là 82,34%.
thành từ các lớp tế bào lát mỏng cắt ngang (tTCL) của lan D. aqueum Lindley. Các tế bào lát mỏng cắt ngang tTCL (dày 0,5 mm) được nuôi cấy trên môi trường 1/2MS + 0,5 mg/l zeatin cho tỷ lệ 41,42% phôi tạo callus/tTCLs; trên môi trường 1/2MS + 1,5 mg/l adenine (2iP) có tới 42,66 phơi soma hình cầu/tTCLs nhưng chỉ chiếm 10,33% phôi soma/tTCLs. Trên môi trường 1/2MS + 1,5 mg/l adenine (2iP) + 0,5 mg/l BA có tới 34 phơi soma hình cầu chiếm 14,7% phơi soma/tTCLs, trong khi sự kết hợp của 2iP + 1 mg/l IBA tạo ra 7,4 phơi soma hình cầu đạt tỷ lệ 52,33% phôi soma/tTCLs.
Nhìn chung các biện pháp nhân giống đã được các tác giả trên thế giới nghiên cứu thành công, từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, mắt ngủ trên thân, lớp mỏng tế bào, tạo hoa và hạt giống trong ống nghiệm. Các tác giả cũng đã xác định được môi trường nuôi cấy, nhân nhanh và tạo cây hồn chỉnh. Trong đó, có sử dụng cả mơi trường hóa sinh và các hợp chất phụ gia tự nhiên. Chất lượng cây giống sau nuôi cấy đạt tiêu chuẩn, có thể đáp ứng cho sản xuất và tiêu dùng.
b) Nghiên cứu về tạo hạt giống nhân tạo lan
- Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản đến tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo.
Việc bảo quản lạnh sâu các nguồn gen thực vật với thời gian bảo quản ổn định trong ni-tơ lỏng là một hướng triển vọng trong lưu giữ các mầm hạt có giá trị. Ở nhiệt độ của ni-tơ lỏng, hầu hết tất cả hoạt động trao đổi chất của tế bào dừng lại và chúng có thể được bảo quản trong trạng thái như vậy với một thời gian kéo dài. Cho đến nay, việc bảo quản lạnh sâu với các lồi lan vẫn cịn rất hạn chế.
Qin et al., (2008) cho rằng lớp vỏ maltose 4%, 6-BA mg/l và αNAA mg/l tỷ lệ 10:1, active carbon 0,1%, sodium alginate 4% cho kết quả khả thi trên đối tượng hạt nhân tạo D. huoshanese với tỷ lệ nảy mầm của hạt đạt cao 90,1%, tỷ lệ sống sót