Từ các kết quả nghiên cứu vừa trình bày ở trên, chúng tơi xây dựng quy trình tạo cây từ hạt nhân tạo sau bảo quản hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ qua 4 bước cơ bản, thể hiện ở sơ đồ hình 3.22.
Bước 1: Hạt nhân tạo (24 tuần)
Bảo quản 4°C trong điều kiện tối trong 24 tuần nhằm làm tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt.
Bước 2: Nhân nhanh protocorm và nhân chồi (8 tuần)
Cấy các hạt nhân tạo sau bảo quản vào môi trường VW + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar + 10% nước dừa + 1 g/l than hoạt tính + 1,5 mg/l BA + 0,5 mg/l PAA + 70 g/l dịch nghiền cà chua, độ pH 5,5, Mục đích: tăng hệ số nhân protocorm, hệ số nhân chồi và chiều cao chồi.
Bước 3: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh (6 tuần)
Tách các chồi từ cụm chồi cấy sang môi trường VW + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar + 10% nước dừa + 1 g/l than hoạt tính + 0,5 mg/l PAA, độ pH 5,5.
Bước 4: Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm (12 tuần)
Khi cây con in vitro ni cấy trong phịng thí nghiệm đạt chiều cao 5 - 6 cm, có 4 - 6 lá và 3 - 5 rễ, đưa bình cây ra ngồi vườn ươm 7 ngày, sau đó cây được rửa hết thạch, rải đều trên khay sạch để trong 4 giờ, khử trùng trong dung dịch 3 g/l carbendazim trong 5 phút rồi trồng vào khay hay chậu đất nung với kích thước chậu (8 x 12 cm).
- Giá thể: Rêu (Sphagnum moss) : xơ dừa (70:30) - Độ ẩm giá thể: 70 - 80%
- Độ ẩm khơng khí: 70 - 80% - Nhiệt độ nuôi trồng: 25 ± 20C - Ánh sáng: Độ che sáng > 70% - Tưới phun sương đều 2 lần/ngày
Hình 3.22 Sơ đồ tóm tắt quy trình nhân giống in vitro sau bảo quản hạt nhân tạo lan Nghệ tâm và Hạc vỹ
3.3 Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc cây con lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) in vitro giai đoạn vườn ươm vỹ (D. aphyllum) in vitro giai đoạn vườn ươm
Giai đoạn chuyển cây in vitro từ phịng thí nghiệm (điều kiện nhân tạo) ra vườn ươm (điều kiện tự nhiên) thường gặp rất nhiều khó khăn như tỷ lệ cây sống thấp, cây sinh trưởng kém và bị sâu bệnh gây hại,...Nguyên nhân do cây in vitro đưa ra vườn ươm rất mẫn cảm với mơi trường, bộ rễ cịn yếu, điều kiện thời tiết khắc nghiệt và khâu xử lý giá thể trước khi trồng chưa phù hợp,...Vì vậy, cần phải xác định thời vụ trồng, giá thể trồng và chế độ dinh dưỡng hợp lý để nâng cao sức sống cây con cũng
Hạt nhân tạo (1)
Bảo quản 4°C trong điều kiện tối (24 tuần)
Nhân nhanh protocorm và nhân chồi (2)
VW + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar + 10% nước dừa + 1 g/l than hoạt tính + 1,5 mg/l BA + 0,5 mg/l PAA + 70 g/l dịch nghiền cà chua, pH 5,5
(8 tuần)
Cây in vitro hoàn chỉnh (3)
VW + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar + 10% nước dừa + 1 g/l than hoạt tính + 0,5 mg/l PAA, pH 5,5
(6 tuần)
Vườn ươm (4)
Giá thể: Rêu (Sphagnum moss) : xơ dừa (70:30) Bón phân: B1- Thái Lan với liều lượng 2 ml/l
Tiêu chuẩn cây xuất vườn: Cây cao 6 - 7 cm, có 6 - 7 lá, 3 - 4 rễ mới (12 tuần)
như tỷ lệ xuất vườn.
3.3.1 So sánh sinh trưởng của cây nhân giống in vitro truyền thống và cây nhân giống in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản
Bảng 3.28 Sinh trưởng của cây nhân giống in vitro truyền thống và cây nhân giống in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản
(12 tuần trồng)
Công thức
Tỷ lệ sống (%)
Chiều cao cây
(cm) Số lá (lá) Số rễ mới (rễ)
NT HV NT HV NT HV NT HV
CT1 81,0 82,0 7,10 ± 0,2 7,00 ± 0,2 6,20 ± 0,5 6,50 ± 0,5 3,30 ± 0,4 3,50 ± 0,5
CT2 80,0 81,0 6,63 ± 0,4 6,58± 0,2 6,10 ± 0,6 6,40 ± 0,4 3,20 ± 0,6 3,40 ± 0,4
Ghi chú: CT1: Cây nhân giống in vitro truyền thống
CT2: Cây nhân giống in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản
Kết quả bảng 3.28 và hình 3.23 cho thấy: Chiều cao cây của hạt nhân tạo thấp hơn có ý nghĩa ở mức 5% so với cây nhân giống in vitro thông thường, biểu hiện rõ nhất ở chỉ tiêu chiều cao cây (6,63 cm so với 7,1 cm ở lan Nghệ tâm và 6,58 cm so với 7,0 cm ở lan Hạc vỹ). Sự chênh lệch về số lượng lá và rễ hầu như không đáng kể. Với cây con phát triển từ hạt nhân tạo, phôi sinh dưỡng phát sinh gần như đồng thời với các phôi khác nên trong quá trình tạo hạt nhân tạo, cần tạo lớp vỏ bọc phôi nhũ để tăng khả năng bảo quản và chuyển đổi thành cây hồn chỉnh. Cây sẽ ít khi bị hiện tượng thủy tinh thể, có khả năng tự dưỡng khi tiếp xúc với mơi trường bên ngồi. Với kích cỡ nhỏ gọn, hạt nhân tạo từ phơi sinh dưỡng có thể được sản xuất hàng loạt, việc bảo quản và vận chuyển dễ dàng.
Từ những kết quả nghiên cứu trên cho thấy có thể sử dụng hạt nhân tạo in vitro của Nghệ tâm và Hạc vỹ bảo quản sau 24 tuần để nhân giống, cung cấp cây con cho sản xuất mà không làm ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát của cây.
Lan Nghệ tâm
Lan Hạc vỹ
Ghi chú: CT1: Cây nhân giống in vitro truyền thống
CT2: Cây nhân giống in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản
Hình 3.23 Sinh trưởng của cây nhân giống in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản và cây nhân giống in vitro thông thường
CT1 CT2
CT2 CT1
3.3.2 Nghiên cứu xác định thời vụ ra ngôi cây con in vitro giai đoạn vườn ươm
Việc xác định được thời vụ phù hợp để đưa cây in vitro ra vườn ươm có ý nghĩa quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến tỷ lệ sống cũng như khả năng sinh trưởng của cây ở giai đoạn vườn ươm. Trong thí nghiệm này, đề tài đã sử dụng các cây in vitro có chiều cao 5 - 6 cm, 4 - 6 lá và 3 - 5 rễ, được trồng trên giá thể rêu ở các thời vụ khác nhau. Kết quả trình bày ở bảng 3.29 và hình 3.24 cho thấy: Trong 4 thời vụ trồng, cây con trồng vụ Thu có tỷ lệ sống cao nhất cho cả 2 loài lan nghiên cứu (78% đối với lan Nghệ tâm; 83% đối với lan Hạc vỹ).
Bảng 3.29 Ảnh hưởng của các thời vụ ra cây đến tỷ lệ sống và khả năng sinh trưởng của cây in vitro giai đoạn vườn ươm
(12 tuần sau trồng)
Thời vụ
Tỷ lệ sống (%) Chiều cao cây
(cm) Số lá (lá) Số rễ mới (rễ) NT HV NT HV NT HV NT HV Vụ Thu (18/8/2016) 78,00 83,00 7,15 7,06 6,30 6,80 3,50 3,46 Vụ Đông (18/11/2016) 62,00 60,00 5,60 5,48 5,60 5,53 2,20 2,10 Vụ Xuân (18/02/2017) 72,0 74,0 6,42 6,54 5,80 6,10 2,73 2,50 Vụ Hè (18/5/2017) 76,00 75,0 6,86 6,70 6,03 6,23 3,00 2,80 CV (%) 4,8 4,6 3,7 3,8 4,4 3,9 LSD0,05 0,15 0,19 0,24 0,24 0,24 0,22
Các chỉ tiêu sinh trưởng của cây con trồng vụ Thu cũng đạt cao nhất, với lan Nghệ tâm, cây con có chiều cao 7,15 cm với 6,3 lá; 3,5 rễ, còn với lan Hạc vỹ các giá trị tương ứng là 7,06 cm; 6,8 lá và 3,46 rễ.
Cây con ra ngơi vào vụ Hè có tỷ lệ sống và các chỉ tiêu sinh trưởng cũng tương đối cao, tỷ lệ sống 76%, chiều cao 6,86 cm, số lá 6,03 lá; số rễ 3,0 rễ với lan Nghệ tâm và tỷ lệ sống đạt 75%, chiều cao 6,7 cm, số lá 6,23 lá; số rễ 2,8 rễ với lan Hạc
vỹ.
Ra ngôi vào vụ Đông, tỷ lệ sống của cây con thấp nhất (62% với lan Nghệ tâm; 60% với lan Hạc vỹ). Bên cạnh đó, các chỉ tiêu sinh trưởng khác như chiều cao cây, số lá của cây con trên 2 lồi ở vụ Đơng cũng kém hơn so với vụ Thu và vụ Hè. Nguyên nhân có thể do vụ Đơng độ ẩm cao, cây có hiện tượng thối lá và rễ. Như vậy, thời vụ ra cây thích hợp cho cả 2 lồi lan trên là vụ Thu.
Hình 3.24 Ảnh hưởng của các thời vụ ra cây đến tỷ lệ sống của cây in vitro ở giai đoạn vườn ươm
3.3.3 Nghiên cứu xác định giá thể cho cây con in vitro ở giai đoạn vườn ươm
Trong giai đoạn vườn ươm, các loại cây trồng khác nhau yêu cầu điều kiện ngoại cảnh khác nhau nên chúng địi hỏi các loại giá thể với các tính chất vật lý và hóa học cũng khác nhau. Nhìn chung, giá thể tốt là giá thể có khả năng giữ ẩm và thốt nước tốt, có khả năng cung cấp dinh dưỡng cho cây con trong giai đoạn đầu để thích ứng dần với mơi trường sống tự nhiên. Cây lan Hồng thảo (Dendrobium) sau ni cấy mơ u cầu độ ẩm cao nhưng không bị úng, nhiệt độ mơi trường khơng q cao, giá thể sạch và có khả năng cung cấp đầy đủ dinh dưỡng cho cây con trong vườn ươm. Để xác định giá thể phù hợp, đề tài tiến hành thí nghiệm ra cây vào vụ Thu và trồng
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Vụ Thu (18/8/2016) Vụ Đông (18/11/2016) Vụ Xuân (18/02/2017) Vụ Hè (18/5/2017) 78 62 72 76 83 60 74 75 T ỷ lệ sống (% ) Thời vụ Tỷ lệ sống (%) NT Tỷ lệ sống (%) HV
trên 4 loại giá thể khác nhau, kết quả được trình bày ở bảng 3.31 và hình 3.25; 3.26; 3.27.
Bảng 3.30 Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sinh trưởng của cây in vitro ở giai đoạn vườn ươm
(sau 12 tuần trồng) Công thức giá thể Tỷ lệ sống (%)
Chiều cao cây (cm) Số lá (lá) Số rễ mới (rễ) NT HV NT HV NT HV NT HV GT1 78 82 7,16 7,04 6,31 6,79 3,43 3,50 GT2 70 60 5,80 5,58 5,48 5,55 2,30 2,23 GT3 94 86 7,80 7,50 7,20 6,79 3,90 3,83 GT4 86 92 7,50 7,88 6,55 7,48 3,60 4,50 CV (%) 4,7 4,8 4,0 4,8 4,1 3,9 LSD0,05 0,4 0,49 0,48 0,35 0,37 0,46 Ghi chú:
GT1: rêu (Sphagnum moss) GT2: xơ dừa GT3: rêu (Sphagnum moss) + đá bọt (50:50) GT4: rêu (Sphagnum moss) + xơ dừa (70:30)
Có thể nhận thấy: giá thể khác nhau cho tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây con in
vitro khác nhau. Trên giá thể rêu, xơ dừa, các chỉ tiêu tỷ lệ sống, chiều cao cây, số lá,
số rễ của cây lan con đều nằm ở mức thấp. Điều này là do rêu có khả năng giữ nước cao, làm giảm độ thơng thống của giá thể và gia tăng mức độ nhiễm nấm bệnh, gây ra hiện tượng thối rễ. Cịn giá thể xơ dừa thốt nước nhanh nên cây dễ bị mất nước, cây yếu lá nhỏ màu xanh nhạt.
Việc lựa chọn giá thể hỗn hợp tốt sẽ tạo điều kiện thốt nước, giữ độ ẩm và hơ hấp tốt, điều này rất cần thiết cho việc sinh trưởng của cây lan con (Xiao and Zhang, 2013). Đối với lan Nghệ tâm trên giá thể rêu + đá bọt (50:50), tỷ lệ sống của cây con cao nhất (94%), khả năng sinh trưởng cũng tốt nhất (chiều cao cây 7,8 cm với 3,9 rễ mới và 7,2 lá/cây).
tốt, các chỉ tiêu tỷ lệ sống của cây con (86%), chiều cao cây (7,5 cm), số rễ mới (3,83), số lá/cây (6,79) gần tương đương với lan Nghệ tâm nhưng giá thể rêu + xơ dừa (70:30) mới đem lại kết quả tốt nhất, tỷ lệ sống, chiều cao cây, số lá và rễ lần lượt là: 92%; 7,88 cm; 7,48 lá và 4,5 rễ mới, cây cứng cáp, lá xanh bóng, rễ khỏe và bám chắc vào giá thể.
Hình 3.25 Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây in vitro ở giai đoạn vườn ươm
Hình 3.26 Cây in vitro lan Nghệ tâm giá thể rêu + đá bọt (50:50)
0 20 40 60 80 100 GT1 GT2 GT3 GT4 78 70 94 86 82 60 86 92 T ỷ lệ sống (% ) Giá thể Tỷ lệ sống (%) NT Tỷ lệ sống (%) HV
Hình 3.27 Cây in vitro lan Hạc vỹ trên giá thể rêu + xơ dừa (70:30)
3.3.4 Nghiên cứu bổ sung chế phẩm dinh dưỡng cho cây con in vitro ở giai đoạn vườn ươm
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại chế phẩm dinh dưỡng khác nhau đến khả năng sinh trưởng của cây in vitro giai đoạn vườn ươm được trình bày ở bảng 3.31 và hình 3.28; 3.29.
Kết quả thu được sau 12 tuần theo dõi cho thấy cây con ở cơng thức đối chứng có sinh trưởng kém hơn các công thức bổ sung dinh dưỡng, chiều cao cây chỉ đạt 6 cm với 5,79 lá; 1,93 rễ mới với lan Nghệ tâm, các giá trị tương tự của lan Hạc vỹ là lần lượt là 6,5 cm; 5,51 lá; 1,83 rễ mới và cây có lá nhỏ, màu xanh nhạt.
Công thức phun dinh dưỡng Ðầu trâu 502 cho cây lan Nghệ tâm và Hạc vỹ sinh trưởng và phát triển ở mức trung bình (cây cao 7,24 - 7,3 cm, 6,62 - 6,79 lá/cây; 3,3 - 3,4 rễ mới/cây).
Ở công thức phun dinh dưỡng Growmore (30:10:10), cây sinh trưởng và phát triển khá tốt, cây có chiều cao 8,3 cm với số lá 7,48; số rễ mới 4,1 đối với lan Nghệ tâm và 8,2 cm chiều cao; 7,82 lá; 4,8 rễ mới đối với lan Hạc vỹ, cây con ở cả hai loài lan tương đối khỏe, màu lá xanh đậm.
Bảng 3.31 Ảnh hưởng của một số loại chế phẩm dinh dưỡng khác nhau đến khả năng sinh trưởng của cây in vitro giai đoạn vườn ươm
(12 tuần sau trồng)
Chế phẩm dinh dưỡng
Chiều cao cây (cm) Số lá (lá) Số rễ mới (rễ) Đặcđiểm hình thái cây NT HV NT HV NT HV Nước lã (Đ/C) 6,00 6,50 5,79 5,51 1,93 1,83 Cây nhỏ,thấp và lá màu xanh nhạt
B1- Thái Lan 9,10 8,76 7,93 8,13 4,60 5,30 Cây mập, khỏe và lá màu xanh bóng Growmore Mỹ (30:10:10) 8,30 8,20 7,48 7,82 4,10 4,80 Cây khỏe và lá xanh đậm Ðầu trâu 502 (30:12:10) 7,30 7,24 6,62 6,79 3,40 3,33 Cây bình thường và lá xanh CV (%) 4,6 4,7 4,5 4,6 4,4 4,6 LSD0,05 0,23 0,29 0,33 0,42 0,29 0,26
Ghi chú: Lan Nghệ tâm trồng trên giá thể thể rêu + đá bọt (50:50) Lan Hạc vỹ trồng trên giá thể rêu + xơ dừa (70:30)
Hình 3.28 Ảnh hưởng của loại chế phẩm dinh dưỡng đến chiều cao của cây
in vitro giai đoạn vườn ươm
0 2 4 6 8 10
Nước lã (Đ/C) B1- Thái Lan Growmore Mỹ
(30:10:10) Ðầu trâu 502 (30:12:10) 6 9.1 8.3 7.3 6.5 8.76 8.2 7.24 Chiều ca o câ y (cm ) Chế phẩm dinh dưỡng
Lan Nghệ tâm
Lan Hạc vỹ
Hình 3.29 Ảnh hưởng của loại chế phẩm dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng của cây in vitro giai đoạn vườn ươm
CT1 CT2 CT3 CT4
CT4
Trong các công thức phun chế phẩm dinh dưỡng, công thức phun hoạt chất B1 Thái Lan cho cây sinh trưởng và phát triển tốt nhất, cây có chiều cao vượt hơn hẳn (9,1 cm với lan Nghệ tâm; 8,76 cm với lan Hạc vỹ) trong lúc các chỉ tiêu số lá, số rễ mới tương đương hoặc cao hơn chút ít so với cơng thức phun Growmore (7,93 lá và 4,6 rễ mới với lan Nghệ tâm; 8,13 lá và 5,3 rễ mới với lan Hạc vỹ), cây mập, bộ lá và rễ phát triển rất tốt.
Như vậy, ở giai đoạn vườn ươm phun chế phẩm dinh dưỡng B1 Thái Lan, phun định kỳ 1 tuần/lần với liều lượng 2 ml/l cho lan Nghệ tâm và Hạc vỹ cho cây sinh trưởng tốt nhất, lá xanh khỏe và bộ rễ mập và dài.
3.4 Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc cây lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) giai đoạn vườn sản suất
3.4.1 Nghiên cứu xác định giá thể cho cây ở giai đoạn vườn sản xuất
Nhằm tìm ra giá thể tốt nhất cho hai lồi lan Nghệ tâm và Hạc vỹ trong giai đoạn vườn sản xuất, chúng tôi sử dụng các chủng loại giá thể đã nghiên cứu trong giai đoạn vườn ươm (bảng 3.32).
Kết quả trình bày ở bảng 3.32 và hình 3.30 cho thấy: Giá thể khác nhau có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng sinh trưởng của lan Nghệ tâm và Hạc vỹ.
Bảng 3.32 Ảnh hưởng của loại giá thể đến khả năng sinh trưởng của lan Nghệ tâm và Hạc vỹ giai đoạn vườn sản suất
(sau 6 tháng trồng) Công thức Giá thể Chiều cao cây (cm) Đường kính thân (cm) Số nhánh (nhánh) Số lá (lá) Chiều dài lá (cm) Chiều rộng lá (cm) NT HV NT HV NT HV NT HV NT HV NT HV CT1 11,75 11,08 0,33 0,32 0,6 0,7 9,2 8,6 4,37 4,26 1,21 1,16 CT2 13,35 11,95 0,37 0,35 1,2 0,9 9,6 9,5 5,05 4,48 1,29 1,25