(Học viện Nông nghiệp Việt Nam, 02/2014 - 06/2015)
Tên lồi Số bó dẫn (bó/ thân)
Số lớp cương mơ (lớp)
Kích thước thân Kích thước bó dẫn lớn Dài (mm) Rộng (mm) Dài (mm) Rộng (mm) Nghệ tâm 31,10 ± 1,43 1-2 2,23 ± 0,11 2,00 ± 0,05 0,15 ± 0,02 0,10 ± 0,01 Hạc vỹ 46,83 ± 3,49 1-2 2,51 ± 0,07 2,34 ± 0,08 0,14 ± 0,02 0,10 ± 0,01
3.1.2.3 Đặc điểm cấu tạo vi phẫu lá Nghệ tâm và Hạc vỹ
Lá của Hạc vỹ và Nghệ tâm cũng có cho thấy cấu trúc tương đồng. Mặt trên và dưới của lá được bao phủ bởi 1 lớp biểu bì với vách tế bào phía tiếp giáp với mơi trường được bao phủ cutin. Nằm giữa 2 lớp biểu bì là mơ mềm đồng hóa, nơi tập trung của lục lạp và làm nhiệm vụ quang hợp tạo ra chất hữu cơ ni cây. Mơ mềm đồng hóa của hai lồi đều có hình bầu dục khác với D. teretifolium có hình tam giác (Stern et al.,1994), tuy nhiên mơ mềm đồng hóa trong lá Hạc vỹ nằm song song với biểu bì trên cịn ở Nghệ tâm thì nằm vng góc với biểu bì trên. Xen kẽ giữa mơ mềm đồng hóa là các bó mạch của gân chính và gân bên, xếp song song với nhau. Hạc vỹ và Nghệ tâm có 1 gân chính và các gân bên tạo thành một hàng ở giữa lát cắt ngang của lá, khác với các loài trong nhánh Aporum và Rhizobium của chi Dendrobium có các gân tạo thành một vòng quanh lát ngang cắt của lá (Stern et al.,1994). Tuy nhiên các bó dẫn của Hạc vỹ nằm sát biểu bì dưới hơn so với các bó dẫn của Nghệ tâm. Các tế bào mô mềm xung quanh các bó dẫn ở lá Nghệ tâm xắp xếp theo kiểu phóng xạ quanh bó dẫn trong khi ở Hạc vỹ khơng rõ xu hướng này (hình 3.5).
Cấu tạo của bó dẫn ở lá Nghệ tâm và Hạc vỹ tương tự như bó dẫn ở thân, gồm có vịng cương mơ bao quanh bó dẫn, phía trong có gỗ và libe (hình 3.5), mạch gỗ hướng về biểu bì trên, cịn libe hướng về phía biểu bì dưới như gặp ở đa số lá của các loài thực vật, khác với 2 loài cùng chi là D. toressae và D. rigidum có các bó dẫn xắp xếp
vịng quanh lát cắt và mạch gỗ hướng về chính giữa phiến lá (Stern et al.,1994). Trong cấu tạo vi phẫu cơ quan sinh dưỡng của hai lồi Hồng thảo thì lá cây thể hiện sự khác biệt nhiều nhất giữa hai loài so với cấu tạo của thân và rễ.
A. Lá Hạc vỹ B. Lá Nghệ tâm
Hình 3.5 Lát cắt ngang qua lá Nghệ tâm và Hạc vỹ Bảng 3.5 Cấu tạo vi phẫu lá Nghệ tâm và Hạc vỹ Bảng 3.5 Cấu tạo vi phẫu lá Nghệ tâm và Hạc vỹ
(Học viện Nông nghiệp Việt Nam, 2014 - 2015)
Tên lồi Dày phiến (mm) Dày mơ đồng hóa (mm) Kích thước bó dẫn ở gân chính Đặc điểm chính Dài (mm) Rộng (mm) Nghệ Tâm 0,88 ± 0,12 0,81 ± 0,12 0,15 ± 0,01 0,12 ± 0,01 Lá cứng, phiến lá hẹp, dày Hạc vỹ 0,35 ± 0,03 0,29 ± 0,02 0,16 ± 0,01 0,11 ± 0,01 Lá mềm, phiến lá rộng, mỏng
Lá của Hạc vỹ mỏng, mềm, phiến lá rộng. Ngược lại, Nghệ tâm có phiến lá dày, cứng và bề rộng của phiến lá hẹp hơn nhiều so với Hạc vỹ. Nghệ tâm có phiến lá dày gấp 2,5 lần phiến lá của Hạc vỹ, mơ đồng hóa dày gấp 2,78 lần mơ đồng hóa của Hạc vỹ. Tuy nhiên, kích thước bó dẫn ở gân chính của hai lồi thì tương tự nhau (bảng 3.5, hình 3.5).
3.1.2.4 Đặc điểm hình thái và cấu tạo hoa của Nghệ tâm và Hạc vỹ
- Đặc điểm hoa của Nghệ tâm
Lan Nghệ tâm có hoa mọc đơn độc trên các thân mang lá, hoa màu trắng ánh tím, với trung tâm màu vàng nghệ. Nằm ở sát gốc cuống hoa có 2 lá bắc con nhỏ, rời nhau, dạng vảy mảnh, màu xám. Cuống hoa dài 0,4 - 0,8 cm, màu xanh lá cây nhạt. Bao hoa có các phiến dạng màng, có màu trắng ánh tím nhạt. Cánh đài có dạng thn, chóp tù; cánh đài bên lớn hơn cánh đài đối diện cánh môi; 2 cánh đài bên dài 2,2 - 2,5 cm, rộng 0,7 cm; cánh đài đối diện cánh môi dài 1,6 - 1,9 cm, rộng 0,7 - 0,8 cm. Cánh tràng hình bầu dục, đỉnh hơi tròn, dài 1,6 - 1,7 cm, rộng 0,8 - 1 cm. Cánh mơi viền ngồi trắng, phần giữa màu vàng nghệ, gốc màu trắng, hình gần trịn, mép lượn sóng có tua rua màu trắng, dài 1,7 - 1,9 cm, rộng 2,1 - 3,1 cm, chia 3 thùy. Các thùy gốc tù, thùy giữa bao rộng; miền giữa có lơng nhung ở họng; gốc màu vàng nghệ. Cánh mơi dính với cột nhị - nhụy ở gốc. Trục nhị nhụy ngắn, có dạng nửa hình trụ, dài 0,7 - 0,8 cm. Bầu nhụy 3 ô, dài 3,1 - 3,5 cm, màu xanh lá cây nhạt. Bao phấn ở ngọn, có nắp tạo thành mũ hơi nhọn, gồm 2 ơ phấn với 4 khối phấn xếp từng đơi một (hình 3.6).
- Đặc điểm hoa của Hạc vỹ
Hạc vỹ có hoa mọc đơn độc hoặc thành cụm 2 - 3 hoa, trên thân già không lá, hoa màu trắng sọc tím với trung tâm màu tím đậm. Nằm ở sát gốc cuống hoa có 2 lá bắc con nhỏ, rời nhau, dạng vảy mảnh, màu xám. Cuống hoa dài 0,2 - 0,6 cm, màu tím nhạt. Bao hoa có các phiến dạng màng, màu trắng ánh tím nhạt. Cánh đài có sọc tím nhạt, thn, nhọn, nhỏ hơn cánh tràng. Ba cánh đài kích thước gần như tương tự nhau: 2 cánh đài bên dài 2,7 - 3,6 cm, rộng 0,7 - 0,9 cm; cánh đài đối diện cánh môi dài 2,5 - 3,1 cm, rộng 0,6 - 0,7 cm. Cánh tràng thuôn, đỉnh hơi nhọn, dài 2,7 - 3,4 cm, rộng 1 - 1,1 cm. Cánh mơi hình gần trịn, mép có tua; dài 3,1 - 3,7 cm, rộng 3 - 3,6 cm;
chia 3 thùy rõ rệt: hai thùy bên có gân sọc tím đậm nổi rõ; thùy giữa màu trắng ngà, có gân trắng nổi rõ ở chính giữa, có lơng nhung bao phủ cả hai mặt. Các thùy gốc tù, thùy giữa bao rộng. Cánh mơi dính với cột nhị - nhụy ở gốc. Trục nhị nhụy ngắn, có dạng nửa hình trụ, dài 0,9 - 1,3 cm. Bầu nhụy 3 ơ, dài 2,4 - 3,1 cm, màu tím nhạt. Bao phấn ở ngọn, có nắp tạo thành mũ hơi nhọn, gồm 2 ơ phấn với 4 khối phấn xếp từng đơi một (hình 3.6).
Mặc dù lan Nghệ tâm và Hạc vỹ là lồi khơng tự thụ phấn nhưng có cả nhị và nhụy ở cùng 1 hoa (hoa lưỡng tính).
A. Hoa Hạc vỹ B. Hoa Nghệ tâm
Hình 3.6 Đặc điểm hình thái và cấu tạo hoa của Nghệ tâm và Hạc vỹ
Trong mô tả của nghiên cứu này, đặc điểm hoa của Hạc vỹ và Nghệ tâm phù hợp với mô tả của (Trần Hợp, 1998; Sách Đỏ Việt Nam, 2007; De et al., 2015) và kết quả giám định mẫu thực vật của Viện sinh Thái và Tài nguyên Sinh vật (2014). So với
các cơng bố trước thì mơ tả này chi tiết và đầy đủ hơn, có ảnh minh họa rõ ràng, sắc nét, đặc biệt có lát cắt ngang qua bầu thể hiện bầu 3 ô đặc trưng cho cây một lá mầm và hình ảnh cho thấy tương quan kích thước các thành phần hoa và bao phấn của hai loài lan Nghệ tâm (NT) và Hạc vỹ (HV) từ đó làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu về thành phần hóa học và các biện pháp kỹ thuật nhân giống và bảo tồn in vitro.
3.1.3 Một số thành phần hóa sinh cơ bản của lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) vỹ (D. aphyllum)
Theo Sunita Shailajan et al., (2015) chi Hoàng thảo (Dendrobium) được biết có chứa một số hoạt chất như: phenol, alkaloids, coumarin, tecpen, flavonoids và polysaccharides. Polysaccharides từ chi Hồng thảo có chức năng điều hịa miễn dịch, chống oxy hoá và hoạt động bảo vệ gan; alkaloids chống đục thủy tinh thể và bảo vệ thần kinh, các hợp chất thơm và sesquiterpenoid có hoạt tính chống tạo mạch, chống khối u và tác dụng chống biến chứng…(Jun Xu, 2015).
Để khẳng định giá trị dược lý của hai loài lan Hoàng thảo Nghệ tâm và Hoàng thảo Hạc vỹ cũng như bổ sung các dẫn liệu khoa học phục vụ cho công tác nhân giống, phát triển ra sản xuất, đề tài đã tiến hành phân tích sơ bộ một số thành phần hóa sinh chủ yếu, bao gồm: polysaccharides, alkaloids và flavonoids tồn phần, protein và các chất khống khác: Ca, Mg, Fe,...kết quả định lượng được trình bày ở bảng 3.6.
- Hàm lượng alkaloids tổng số: Kết quả cho thấy hàm lượng alkaloids tổng số trong mẫu Nghệ tâm và mẫu Hạc vỹ tương đương nhau. Theo Seru Ganapaty et al., (2013), hàm lượng alkaloids trong loài D. ovatum (L.) Kraenzl đạt 0,048%; theo Zhu
et al., (2010), loài D. officinale đạt khoảng từ 0,019% - 0,043%; Caimei Gu et al.,
(2017), hàm lượng alkaloids trong D. officinale đạt (0,132%) và lan Nghệ tâm đạt (0,109%). Như vậy, hàm lượng alkaloids trong hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ nằm ở mức khá cao (0,35%).
- Hàm lượng flavonoids toàn phần: Cho đến nay, hàm lượng flavonoid trong hai loài lan Hạc vỹ và Nghệ tâm chưa từng được công bố ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Tuy nhiên, trên một số loài khác cùng chi Dendrobium, một số tác giả đã có
5,34% (Seru Ganapaty et al., 2013), điều này cho thấy hàm lượng flavonoids toàn
phần trong hai mẫu nghiên cứu tương đối thấp (0,92% ở lan Nghệ tâm và 0,56% ở lan Hạc vỹ).
- Hàm lượng polysaccharides toàn phần: mẫu lan Nghệ tâm có hàm lượng polysaccharides toàn phần đạt 1,42% và lan Hạc vỹ 4,2%, cao hơn nhiều so với flavonoids và alkaloids.
Bảng 3.6 Kết quả định lượng một số thành phần hóa sinh cơ bản có trong hai lồi lan Nghệ tâm và Hạc vỹ
(Viện Dược liệu, 2013 - 2014)
TT Nhóm chất Nghệ tâm
(D. loddigesii)
Hạc vỹ
(D. aphyllum)
1 Hàm lượng Alkaloids toàn phần (%) 0,35 0,35 2 Hàm lượng Flavonoids toàn phần (%) 0,92 0,56 3 Hàm lượng Polysaccharids toàn phần (%) 1,42 4,20
4 Hàm lượng Protein (%) 6,00 6,60
5 Hàm lượng Ca (mg/kg) 12030 14821
6 Hàm lượng Mg (mg/kg) 1726 2829
7 Hàm lượng Fe (mg/kg) 168 134
- Hàm lượng protein và chất khoáng (Ca, Mg, Fe) ở mẫu lan Nghệ tâm là protein (6%), Ca (12030 mg/kg), Mg (1726 mg/kg), Fe (168 mg/kg) và lan Hạc vỹ là protein (6,6%), Ca (14821 mg/kg), Mg (2829 mg/kg), Fe (134 mg/kg).
Kết quả phân tích các thành phần hóa học chủ yếu trên đây cho thấy hai lồi lan Nghệ tâm và Hạc vỹ có giá trị làm dược liệu rất tốt so với loài lan Hoàng thảo (D.
officinale) ghi trong Dược điển Trung Quốc (Pharmacopoeia Commission of PRC,
2010), D. officinale được xếp vào loại cây thuốc có khả năng kháng khuẩn, chống oxy hóa, tăng cường hệ miễn dịch, ức chế tế bào ung thư, tăng tuổi thọ, chữa bệnh tiểu đường, cao huyết áp,…(Chunyan Yao et al., 2012).
Các đặc điểm hình thái, vi phẫu, thành phần hóa sinh của hai mẫu giống Nghệ tâm (NT) và Hạc vỹ (HV) trong nghiên cứu của chúng tơi được trình bày ở trên có sự phù
hợp cao với các kết quả mơ tả của Trần Hợp, 1998; Sách Đỏ Việt Nam, 2007; Zhu Guanghua et al., 2009 và đặc biệt là kết quả giám định mẫu thực vật của Viện sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, 2014 (phụ lục 2.1). Điều này, thêm một lần nữa khẳng định tầm quan trọng của việc phát triển hai loài lan Hoàng thảo Nghệ tâm và Hạc vỹ phục vụ cho sản xuất dược liệu, trang trí, thưởng ngoạn…đồng thời làm cơ sở khoa học cho đề tài thực hiện các nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn hai loài lan quý hiếm của Việt Nam.
3.2 Nghiên cứu biện pháp kỹ thuật nhân giống in vitro, tạo hạt giống nhân tạo và nhân giống in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản hai loài lan Nghệ tâm (D. và nhân giống in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản hai loài lan Nghệ tâm (D.
loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum)
3.2.1 Xác định chất khử trùng và thời gian khử trùng của mẫu ni cấy
Với bất cứ lồi cây trồng nào, việc lựa chọn loại hóa chất, nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp có ý nghĩa quan trọng đến thành cơng của q trình ni cấy in
vitro. Các yêu cầu cần đạt được trong giai đoạn này là: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống
cao, mơ tồn tại, phân hóa và sinh trưởng tốt.
3.2.1.1 Ảnh hưởng của chất khử trùng NaOCl và thời gian khử trùng lên mẫu cấy
Các mẫu nuôi cấy là chồi đỉnh của lan Nghệ tâm (NT) và Hạc vỹ (HV) được đưa vào khử trùng bằng NaOCl là nhóm chất ít gây độc hại. Sau 6 tuần ni cấy, kết quả được trình bày ở bảng 3.7.
Bảng 3.7 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng NaOCl lên mẫu cấy
(Trung tâm Sinh học Thực nghiệm, 2013 - 2014)
Thời gian và nồng độ xử lý (NaOCl) Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) NT HV NT HV NT HV 3% NaOCl trong 5 phút 3,6 2,2 80,0 80,6 16,4 17,2 3% NaOCl trong 10 phút 9,0 6,0 57,0 58,5 34,0 33,5 3% NaOCl trong 15 phút 11,9 7,3 25,1 29,2 63,0 63,5 3% NaOCl trong 20 phút 31,4 31,5 16,2 15,2 52,4 53,3 3% NaOCl trong 25 phút 67,0 61,3 11,4 12,3 21,6 26,4
Trong phạm vi từ 5 đến 15 phút, tỷ lệ mẫu sống tăng theo chiều thuận, sau đó giảm nhẹ ở ngưỡng 20 phút và khi tăng thời gian khử trùng lên 25 phút, tỷ lệ mẫu sống giảm xuống khá rõ (21,6 - 26,4%) trong lúc tỷ lệ mẫu chết lại có xu hướng tăng lên (61,3 - 67%). Kết quả này cho thấy NaOCl là chất khử trùng chưa có hiệu quả đối với mẫu lan Nghệ tâm và Hạc vỹ đưa vào nuôi cấy in vitro, và cũng chính vì vậy đề tài tiếp tục thử nghiệm với loại chất khử trùng khác NaOCl kết hợp với chất kháng sinh cefotaxime.
3.2.1.2 Ảnh hưởng của chất kháng sinh cefotaxime (cef) và 3% NaOCl đến khả năng sống và vô trùng của mẫu cấy
Kết quả thể hiện ở bảng 3.8 cho thấy, việc bổ sung cefotaxime vào mơi trường ni cấy có tác dụng cải thiện rõ đến tỷ lệ mẫu sống và gần như không gây ảnh hưởng nhiều đến sức sống của mẫu cấy. Sau 6 tuần theo dõi, tỷ lệ mẫu sống đạt cao nhất (79,9% với lan Nghệ tâm; 86% với lan Hạc vỹ) ở nồng độ 3% NaOCl (15 phút) và 1‰ cefotaxime, trong khi các công thức đối chứng chỉ đạt 63,1 - 63,4%. Như vậy, có thể thấy kháng sinh có tác dụng khử trùng rất tốt đối với hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ.
Bảng 3.8 Ảnh hưởng của chất kháng sinh cefotaxime (cef) và 3% NaOCl đến khả năng sống và vô trùng của mẫu cấy
(Trung tâm Sinh học Thực nghiệm, 2013 - 2014)
Thời gian và nồng độ xử lý (‰ cefotaxime) Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) NT HV NT HV NT HV CT1 (3% NaOCl trong 15 phút) 11,8 7,2 25,1 29,2 63,1 63,4 CT1 + 0,5‰ cefotaxime 13,2 8,5 18,2 21,3 68,6 70,2 CT1 + 1‰ cefotaxime 14,1 10,0 6,0 4,0 79,9 86,0 CT1 + 1,5‰ cefotaxime 24,8 24,6 3,8 3,2 71,4 72,2 CT1 + 2‰ cefotaxime 38,9 37,4 2,3 2,5 58,8 60,1
Từ kết quả trên đây, đề tài đã xác định công thức khử trùng phù hợp nhất cho cả hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ là xử lý 3% NaOCl trong 15 phút với 1‰ cefotaxime.
Hình 3.7 Mẫu nảy chồi sau 6 tuần nuôi cấy
3.2.2 Nghiên cứu tạo vật liệu protocorm like bodies (PLBs) từ lát mỏng tế bào
nằm ngang (tTCL)
3.2.2.1 Ảnh hưởng của BA đến khả năng tạo PLBs từ lát mỏng tế bào nằm ngang (tTCL)
Lát mỏng tế bào nằm ngang (tTCL) được cấy lên môi trường VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar bổ sung BA từ 0,5 - 3 mg/l để khảo sát ảnh hưởng của BA lên khả năng phát sinh PLBs. Kết quả sau 6 tuần ni cấy trình bày ở bảng 3.9 cho thấy: Bổ sung BA vào mơi trường ni cấy có tác động rất tích cực tới khả năng cảm ứng tạo PLBs trực tiếp từ tTCL.
Trên môi trường VW bổ sung 1,5 mg/l BA, số PLBs hình thành đạt cao nhất (30,1 PLBs/tTCL), tỷ lệ tTCL phát sinh PLBs là 52%, 28,7 PLBs/tTCL với lan Nghệ tâm, tỷ lệ tTCL phát sinh PLBs là 49,2% với lan Hạc vỹ sau 6 tuần nuôi cấy, trong khi công thức đối chứng (không bổ sung BA) khơng có khả năng phát sinh hình thái sau 6 tuần nuôi cấy.
Khi tiếp tục tăng nồng độ BA từ 1,5 mg/l đến 3 mg/l, khả năng tạo PLBs giảm dần, điều này có thể do nồng độ BA cao đã gây ức chế đến sự phát sinh PLBs từ tTCL. Kết quả thấp nhất khi bổ sung nồng độ 3 mg/l BA vào môi trường với tỷ lệ
tTCL phát sinh PLBs chỉ đạt 10% với 8,5 PLBs/tTCL với lan Nghệ tâm và tỷ lệ tTCL