CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Vật liệu nghiên cứu
2.1.1 Vật liệu thực vật
- Mẫu giống sử dụng trong đánh giá đặc điểm hình thái, vi phẫu và phân tích thành phần hóa sinh là mẫu lan Nghệ tâm (D. loddigesii) được thu thập ở Định Hóa - Thái Nguyên và Hạc vỹ (D. aphyllum) được thu thập ở Hịn Bà - Khánh Hịa. - Vật liệu ni cấy mô chồi ngọn của mẫu lan Nghệ tâm và mẫu Hạc vỹ có chiều cao 7 - 10 cm.
- Vật liệu tạo phôi sinh dưỡng: Các PLBs (protocorm like bodies) tạo thành sau 6 tuần, hình thành từ ni cấy đỉnh sinh trưởng. Sau 6 tuần nuôi cấy, các PLBs đồng nhất sẽ được cắt ra với kích thước 3 - 4 mm để làm nguyên liệu tạo hạt nhân tạo. - Giai đoạn vườn ươm: Cây in vitro được nhân giống từ hạt nhân tạo: đạt chiều cao 5 - 6 cm, có 4 - 6 lá và 3 - 5 rễ.
- Giai đoạn vườn sản xuất: Cây có chiều cao 6 -7 cm, 6 - 7 lá/cây, 3 - 4 rễ mới.
2.1.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
- Vi phẫu
Hóa chất: Nước Javen, glycerin, xanh methylen 0,01%, carmin-phèn chua 3%... Thiết bị: Kính hiển vi có gắn trắc vi thị kính, lá kính (lamel) và phiến kính (lamd)…
- Phân tích dược tính
+ Hóa chất phân tích: methanol, ethanol 96%, AlCl3, HCl...
+ Tủ bảo quản mẫu (Libherr, Nhật), máy quang phổ: Specord 40 Analytikjena (Đức), máy UV-Vis V630 (Hoa Kỳ), cân phân tích Mettler Tolendo ML204 (Thụy Sỹ) có độ chính xác đến 0,1 mg, thiết bị cơ chân khơng Heidolph (Đức)....
- Hóa chất mơi trường và trang thiết bị cho nhân giống in vitro và tạo hạt nhân
tạo lan
+ Mơi trường ni cấy và hóa chất
Bột sodium alginate, dung dịch CaCl2.2H2O.
Các chất điều tiết sinh trưởng, N6-benzyladenine (BA), Indolbutyride acid (IBA), sucrose, activated carbon (AC), carbendazim, absisic acid (ABA),... Môi trường tái sinh hạt nhân tạo sau bảo quản VW + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar + 10% nước dừa + 1 g/l THT.
Chất khử trùng NaOCl, cefotaxime.
Các hợp chất hữu cơ tự nhiên: bí ngơ, tảo Spirulina, cà chua, nước dừa… + Trang thiết bị
Buồng cấy vô trùng (Bioiogical safety Cabinets), nồi hấp khử trùng (Auto Clave) của hãng Tomy Nhật Bản, cân điện tử, máy đo pH, tủ sấy của Đức, bình tam giác có kích thước từ 250 ml - 500 ml, pipet loại 1ml,…
+ Giá thể
Rêu (Sphagnum moss) dạng sợi dài 3 - 5 cm được làm ẩm và xử lý nấm bệnh; vỏ thơng đỏ “Orchiata” kích thước 0,9 - 1,2 cm xuất xứ New Zealand.
Xơ dừa sợi và Dớn bảng kích thước 20 cm x 30 cm x 3 cm, xuất xứ Việt Nam Ðá bọt núi lửa kích thước 1 - 2 cm, xuất xứ Indonisea
+ Chế phẩm dinh dưỡng và chất điều tiết sinh trưởng
Growmore (30: 10: 10) có nguồn gốc từ Mỹ, nhập khẩu từ Công ty TNHH Tư vấn - Thương mại Mai Huy: Thành phần: N: 30%; P2O5: 10%; K2O: 10%; Cu: 0,05%; Fe: 0,10%; Mn: 0,05%; Mo: 0,0005%; Zn: 0,05%, giúp cây đẻ nhánh khoẻ, ra lá tốt. Growmore (20: 20: 20) có nguồn gốc từ Mỹ, nhập khẩu từ Công ty TNHH Tư vấn - Thương mại Mai Huy: Thành phần: N: 20%; P2O5: 20%; K2O: 20%; Cu: 0,05%; Fe: 0,10%; Mn: 0,05%; Mo: 0,0005%; Zn: 0,05%, gia tăng sức đề kháng cho cây lan, cây cứng cáp, giữ hoa bền lâu,…
B1 Thái Lan, nhập khẩu từ Công ty TNHH Tư vấn - Thương mại Mai Huy: Thành phần: P2O5:2,0%; Fe: 0,10%; Fe - EDTA: 0,10%; B1: 0,10 %; αNAA: 0,04%, giúp cây sinh trưởng và phát triển tốt.
Đầu trâu 502 (30:12:10) của Cơng ty phân bón Bình Điền: Thành phần N: 30%, P2O5: 12%, K2O: 10%, CaO: 0,05%, MgO: 0,05%, Zn: 0,05%, Cu: 0,05%, B: 0,02%,
Fe: 0,01%, Mn: 0,01%, Mo: 0,001%, Penac p, GA3, αNAA, NOA: 0,002%), làm tăng khả năng đẻ nhánh, nảy chồi, ra lá mới,…
Orchid Focus grow (1.8 : 1.2 : 2.1) có nguồn gốc từ Tây Ban Nha, Nhập khẩu Công ty TNHH Tư vấn - Thương mại Mai Huy: Thành phần: N: 1,83%; P2O5: 1,19%; K2O: 2,15%; CaO: 1,72%; Cu: 0,0002%; Fe: 0,040%; Mn: 0,010%; Mo: 0,001%; Zn: 0,0025%, ngồi ra cịn chứa Mg, S, Bo, humic acid, fulvic acid, giúp cho cây sinh trưởng phát khỏe mạnh, ra lá nhiều, lá mập, giữ hoa bền lâu.
Phân hữu cơ Seaweed (Rong biển) 95% có nguồn gốc từ Canada và đóng gói tại Cơng ty TNHH Thương mại Quốc Bảo: Thành phần: Chất hữu cơ: 50%, N: 1.5%, P2O5: 3%, K2O: 20%, S: 1,5%; Mg: 0,45%; B: 125ppm; Fe: 200ppm; Mn:10ppm; Cu: 30ppm; Zn: 65 ppm; axitamin: 5,39%; Cytokinin: 600ppm; Auxin: 37ppm; Gibberellin: 21 ppm, giúp cây phát triển bộ rễ sinh trưởng tốt, tăng khả năng ra chồi, ra hoa, đậu quả, tăng năng suất và chất lượng sản phẩm.
Chất có khả năng điều tiết sinh trưởng
Chất kích thích tăng trưởng Superthrive có nguồn gốc từ Mỹ, nhập khẩu từ Công ty TNHH Tư vấn - Thương mại Mai Huy: Thành phần: 0,09% vitamin B1; 0,048% 1-Napthyl acetic acid (NAA), tăng cường hệ thống rễ cho cây, tác dụng kích thích sinh trưởng, ra rễ nảy chồi, ra hoa.
Thuốc phòng trừ bệnh
Antracol 70WP, được phân phối Công ty TNHH Bayer CropScience Việt Nam, Thành phần Propineb: 700 g/kg; phụ gia: 300 g/kg, kích thích bộ rễ cây phát triển rất mạnh, rễ nhiều, phòng bệnh bệnh vàng lá, thối rễ. Liều lượng phun 0,1%.