(sau 6 tuần nuôi cấy)
Nồng độ PAA (mg/l)
Chiều cao
cây (cm) Số lá (lá) Số rễ (rễ) Chiều dài rễ (cm) NT HV NT HV NT HV NT HV 0,0 (Đ/C) 3,53 3,52 3,00 3,00 2,50 2,50 1,10 1,15 0,5 6,16 6,96 5,18 5,7 6,50 7,40 2,46 3,02 1,0 5,42 5,50 5,46 5,1 5,40 5,90 2,00 2,20 1,5 5,10 5,22 5,08 4,8 4,50 5,20 1,30 1,60 2,0 4,20 4,60 5,02 4,2 3,60 4,50 0,92 1,03 CV (%) 3,3 3,3 4,5 3,1 4,0 3,2 2,7 3,1 LSD0,05 0,79 0,31 0,35 0,42 0,34 0,46 0,91 0,19 Ghi chú: Môi trường nền (VW + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar + 10% nước dừa + 1 g/l THT)
Hình 3.10 Tạo cây lan Nghệ tâm in vitro hồn chỉnh
Hình 3.11 Tạo cây lan Hạc vỹ in vitro hoàn chỉnh
Số liệu bảng bảng 3.15 cho thấy: Bổ sung PAA vào mơi trường ni cấy đã có tác dụng tích cực đến chiều cao cây, số lá và sự hình thành rễ từ chồi in vitro. Ở nồng độ 0,5 mg/l PAA, sau 6 tuần nuôi cấy cây đạt các chỉ tiêu sinh trưởng tốt nhất đối với Nghệ tâm: chiều cao cây đạt 6,16 cm, số lá 5,18 lá/cây, số rễ 6,50 rễ/cây, chiều dài rễ đạt 2,46 cm và chiều cao cây đạt 6,96 cm, số lá 5,7 lá/cây, số rễ 7,4 rễ/cây, chiều dài
rễ đạt 3,02 cm với lan Hạc vỹ, cao hơn hẳn so với đối chứng không bổ sung PAA (các chỉ tiêu tương ứng là 3,53 cm; 3 lá/cây; 2,5 rễ/cây và 1,1 cm với lan Nghệ tâm; 3,52 cm; 3,0 lá/cây; 2,5 rễ/cây và 1,15 cm với lan Hạc vỹ). Tuy nhiên, khi tăng nồng độ PAA trên mức 0,5 mg/l, sự ức chế sinh trưởng của rễ đã xảy ra, số rễ giảm, rễ mảnh và ngắn.
Như vậy, có thể kết luận, bổ sung IBA ở nồng độ 1 mg/l có tác dụng tốt nhất đối với lan Nghệ tâm và bổ sung PAA nồng độ 0,5 g/l có hiệu quả nhất đối với lan Hạc vỹ. Điều này cho thấy các chất điều hòa sinh trưởng IBA và PAA đều tác động tích cực đến việc hình thành và phát triển bộ rễ các lồi lan, trong đó PAA cịn có ưu điểm là giá rẻ và dễ thực hiện. Trong một cơng trình nghiên cứu tương tự trên loài
Chickpea. Kiran Ghanti et al., (2009) cũng có chung nhận xét như trên.
Từ các kết quả nghiên cứu trên có thể tóm tắt quy trình nhân giống lan Nghệ tâm và Hạc vỹ bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào gồm 5 bước được thể hiện ở hình 3.12 và 3.13.
Bước 1: Chọn nguyên liệu khởi đầu
Chồi đỉnh (7 - 10 cm) lấy từ cây mẹ trưởng thành nhằm hạn chế tối đa mẫu nhiễm và sự biến dị soma về sau.
Bước 2: Khử trùng mẫu
Các mẫu cây được khử trùng bằng 3% NaOCl (15 phút với l‰ cefotaxime)
Bước 3: Tạo tạo vật liệu PLBs từ tTCL (6 tuần)
Bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng vào môi trường nền theo 2 cách sau đây: Trên môi trường VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar + 1 g/l than hoạt tính bổ sung 1,5 mg/l BA, pH 5,5 với lan Nghệ tâm
Trên môi trường VW + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar + 10% nước dừa bổ sung 1,5 mg/l BA + 0,5 mg/l αNAA, pH 5,5 với lan Hạc vỹ
Bước 4: Tái sinh chồi từ PLBs (8 tuần)
Trên môi trường VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar + 1 g/l than hoạt tính + 2 g/l peptone + 1,5 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA bổ sung 30 g/l dịch nghiền bí ngơ + 1 g/l tảo Spirulina, độ pH 5,5
Bước 5: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh (6 tuần)
Tách các chồi từ cụm chồi cấy sang môi trường VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar + 1 g/l than hoạt tính, bổ sung 1 mg/l IBA hoặc 0,5 g/l PAA, pH 5,5.
Hình 3.12 Sơ đồ tóm tắt quy trình nhân giống lan Nghệ tâm bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào
Vật liệu nuôi cấy (1)
Chồi đỉnh (7 - 10 cm)
Khử trùng mẫu (2)
3% NaOCl (15 phút với 1‰ cefotaxime)
Tạo vật liệu PLBs từ tTCL (3)
VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar + 1 g/l than hoạt tính + 1,5 mg/l BA, pH 5,5
(6 tuần)
Tái sinh chồi từ PLBs (4)
VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar + 1 g/l than hoạt tính + 2 g/l peptone + 1,5 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA + 30 g/l dịch nghiền bí ngơ + 1
g/l tảo Spirulina, pH 5,5 (8 tuần)
Tạo cây in vitro hoàn chỉnh (5)
VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar + 1 g/l than hoạt tính + 1 mg/l IBA, pH 5,5
Hình 3.13 Sơ đồ tóm tắt quy trình nhân giống lan Hạc vỹ bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào
3.2.5 Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo
Hiện nay, trên thế giới cũng như ở Việt Nam, nhân giống lan thường thực hiện bằng kỹ thuật nuôi cấy mô với ưu điểm hệ số nhân cao, số lượng cây giống lớn và
Vật liệu nuôi cấy (1)
Chồi đỉnh (7 - 10 cm)
Khử trùng mẫu (2)
3% NaOCl (15 phút với 1‰ cefotaxime)
Tạo vật liệu PLBs từ tTCL (3)
VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar + 1 g/l than hoạt tính + 1,5 mg/l BA + 0,5 mg/l αNAA, pH 5,5
(6 tuần)
Tái sinh chồi từ PLBs (4)
VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar + 1 g/l than hoạt tính + 2 g/l peptone + 1,5 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA + 30 g/l dịch nghiền bí
ngơ + 1 g/l tảo Spirulina, pH 5,5 (8 tuần)
Tạo cây in vitro hoàn chỉnh (5)
VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar + 1 g/l than hoạt tính + 0,5 g/l PAA, pH 5,5
đồng đều. Tuy nhiên, phương pháp vi nhân giống các loài lan này, đặc biệt cho lan Nghệ tâm và Hạc vỹ cịn gặp phải một số khó khăn như chi phí sản xuất cao, phải vào mẫu thường xuyên, thời gian bảo quản ngắn, chiếm nhiều diện tích và dễ tổn thương trong q trình vận chuyển. Cơng nghệ tạo hạt nhân tạo không chỉ nhân nhanh được với khối lượng cây lớn, giúp vận chuyển, bảo quản dễ dàng hơn mà còn được sử dụng để bảo tồn các nguồn gen quý hiếm, nguồn gen đang có nguy cơ tuyệt chủng. Hiện nay, nghiên cứu tạo hạt giống nhân tạo đã được thực hiện trên một số loài lan: Hồ điệp (Phalaenopsis amabilis) (Dương Tấn Nhựt et al., 2007), Hoàng thảo dẹt (D.
nobile Lindl.) (Padmaja et al., 2013),…Vì vậy, đề tài nghiên cứu tạo hạt giống nhân
tạo cho hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ từ protocorm like bodies, nhằm góp phần phục vụ công tác sản xuất giống và bảo tồn nguồn gen quý hiếm.
3.2.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate (%) và CaCl2.2H2O (mM) đến khả năng tạo hạt và nảy mầm của hạt nhân tạo
Lớp vỏ nhân tạo bao bọc bên ngồi phơi sinh dưỡng được xem như nội nhũ nhân tạo, không chỉ cung cấp chất dinh dưỡng cho phơi nảy mầm mà cịn bảo vệ phơi khỏi chấn thương cơ học trong suốt quá trình nảy mầm hay xử lý khi bảo quản. Tuy nhiên, độ cứng của lớp vỏ này đã tạo nên một mơi trường kỵ khí bên trong vỏ hạt, có thể ức chế q trình hơ hấp của phơi. Q trình tạo hạt nhân tạo với lớp bọc alginate dựa trên sự trao đổi ion Na+ và ion Ca2+ để hình thành lớp vỏ chứa ion Ca2+. Vì vậy, nồng độ sodium alginate cũng như thời gian tiếp xúc để thực hiện phản ứng trao đổi giữa chúng đều có ảnh hưởng đến hình dạng, kích thước, màu sắc, độ chắc và khả năng nảy mầm của hạt.
Kết quả ở bảng 3.16 cho thấy: Kích thước, màu sắc và độ chắc của hạt nhân tạo phụ thuộc vào nồng độ của dung dịch sodium alginate và CaCl2.2H2O. Ở nồng độ 4% sodium alginate với dung dịch CaCl2.2H2O 125 mM hạt nhân tạo rắn, chắc tuy có kích thước khơng đồng đều. Độ rắn của hạt ảnh hưởng đến khả năng nảy mầm của hạt, nhìn chung hạt rất cứng, nên khả năng phá vỡ lớp vỏ bên ngồi của phơi để tiếp tục sinh trưởng bình thường, hình thành chồi và rễ cũng gặp khó khăn.
Các nồng độ 3% sodium alginate với dung dịch CaCl2.2H2O 100; 125 mM và 4% sodium alginate với dung dịch CaCl2.2H2O 100 mM được coi là thích hợp cho việc hình thành hạt nhân tạo cho cả hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ. Các hạt tạo từ các dung dịch này được nuôi cấy để khảo sát khả năng nảy mầm của chúng.
Bảng 3.16 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch sodium alginate và CaCl2.2H2O đến sự hình thành vỏ hạt nhân tạo lan Nghệ tâm và Hạc vỹ
(sau 12 tuần nuôi cấy)
Nồng độ sodium alginate (%) Nồng độ CaCl2.2H2O (mM)
Đặc điểm của hạt nhân tạo
2 75 Kích thước khơng đồng đều, hạt dễ vỡ, q mềm, có đi dài
2 100 Kích thước khơng đồng đều, hạt dễ vỡ, mềm, có đi dài
2 125 Kích thước khơng đồng đều, hạt dễ vỡ, mềm, có đi ngắn
3 75 Kích thước đồng đều, rắn, có đi 3 100 Trong, chắc, trịn và kích thước đồng đều 3 125 Trong, chắc, trịn và kích thước đồng đều 4 75 Kích thước đồng đều, trịn, trong mờ và khá rắn 4 100 Kích thước đồng đều, rắn, chắc, trong, trịn
4 125 Rất rắn, chắc, tròn, trong
Bảng 3.17 Ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate (%) và CaCl2.2H2O (mM) đến tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo lan Nghệ tâm và Hạc vỹ
(sau 12 tuần nuôi cấy)
Nồng độ sodium alginate (%)
Nồng độ CaCl2.2H2O
(mM)
Tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo (%)
NT HV
3 100 92,0 95,2
3 125 70,2 65,6
4 100 55,6 50,5
Kết quả ở bảng 3.17 cho thấy: Trong dung dịch 3% sodium alginate và dung dịch CaCl2.2H2O 100 mM ngâm trong 30 phút, khả năng nảy mầm của hạt nhân tạo đạt cao nhất (92% đối với lan Nghệ tâm; 95,2% đối với lan Hạc vỹ). Khi tăng nồng độ sodium alginate lên 4% và dung dịch CaCl2.2H2O 125 mM, tỷ lệ nảy mầm của hạt đạt thấp nhất (36% đối với lan Nghệ tâm và 33,5% đối với lan Hạc vỹ).
3.2.5.2 Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với dung dịch 100 mM CaCl2.2H2O đến khả năng tạo hạt, nảy mầm và khả năng sinh trưởng của hạt nhân tạo
Bảng 3.18 Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với dung dịch 100 mM CaCl2.2H2O đến khả năng nảy mầm và khả năng sinh trưởng của hạt nhân tạo
(sau 12 tuần nuôi cấy)
Thời gian tiếp xúc với dung dịch 100 mM CaCl2.2H2O (phút) Đặc điểm của hạt tạo thành Tỷ lệ nảy mầm (%) Số chồi/ hạt Chiều cao chồi (mm) Tỷ lệ ra rễ (%) Số rễ /hạt NT HV NT HV NT HV NT HV NT HV 10 Kích thước khơng đồng đều, hạt dễ vỡ, mềm 29,6 42,0 1,4 1,6 6,0 6,2 12,6 14,0 2,1 2,4 20 Hạt mềm, tròn, trong 42,0 58,0 1,6 1,8 8,4 9,2 60,2 61,6 2,2 2,6 30 Kích thước đồng đều, trong, chắc, tròn 86,4 95,5 2,4 2,8 8,8 9,6 92,0 98,2 3,0 3,2 40 Rắn, tròn, đục 26,2 29,6 1,0 1,5 5,5 6,1 60,8 74,5 1,9 2,1 CV (%) 3,8 2,3 4,0 3,0 4,5 2,8 LSD 0,05 0,33 0,7 2,0 0,3 1,2 0,4
Số liệu bảng 3.18 và hình 3.14 cho thấy: Thời gian để hạt tiếp xúc với dung dịch CaCl2.2H2O 100 mM trong 30 phút cho kết quả tốt nhất, các hạt hình thành có kích thước đồng đều, trong, chắc, tròn và cho tỷ lệ nảy mầm cao nhất (86,4% với lan Nghệ tâm; 95,5% với lan Hạc vỹ). Khi giảm thời gian hạt tiếp xúc trong dung dịch CaCl2.2H2O 100 mM xuống dưới 20 phút, số lượng ion Na+ trao đổi với ion Ca2+ ít, do đó các hạt hình thành mềm, dễ vỡ, kích thước khơng đồng đều, có hình dạng khơng
xác định, làm giảm sự nảy mầm của hạt.
Hình 3.14 Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với dung dịch 100 mM CaCl2.2H2O đến khả năng nảy mầm của hạt nhân tạo
Ngược lại, khi hạt tiếp xúc trong dung dịch CaCl2.2H2O 100 mM trên 30 phút các hạt hình thành cứng nên ngăn cản sự phá vỡ lớp vỏ bên ngồi để hình thành chồi tới tỷ lệ nảy mầm của hạt giảm. Như vậy, nồng độ 3% sodium alginate trong vỏ hạt với thời gian tiếp xúc trong dung dịch CaCl2.2H2O 100 mM 30 phút là thích hợp nhất, cho tỷ lệ hạt nảy mầm đạt cao nhất với hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu trên đối tượng Dâu tây (Strawberry) (Awatef et al., 2013); Địa lan (Cymbidium finlaysonianum Lindl) (Sutha Klaocheed et al., 2018)
Với chỉ tiêu chiều cao chồi, kết quả nghiên cứu bảng 3.19 cho thấy: để hạt tiếp xúc với dung dịch CaCl2.2H2O 100 mM trong 30 phút, chồi có chiều cao tốt nhất (8,8 mm với lan Nghệ tâm và 9,6 mm với lan Hạc vỹ). Tăng thời lượng tiếp xúc lên 40 phút, chiều cao cây đạt thấp nhất (5,5 mm với lan Nghệ tâm và 6,1 mm với lan Hạc vỹ).
Như vậy, vai trò lớp vỏ hydrogel đã tạo cho sodium alginate trở thành một vật liệu khá tốt tham gia vào thành phần của lớp vỏ bọc.
29.6 42 86.4 26.2 42 58 95.5 29.6 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 CT1 (10 phút) CT2 (20 phút) CT3 (30 phút) CT4 (40 phút) T ỷ lệ nảy m ầm của hạt nhân tạo (%)
Thời gian tiếp xúc với dung dịch 100 mM CaCl2.2H2O (phút)
Tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo (%) HV Tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo (%) NT
3.2.5.3 Ảnh hưởng của BA, tổ hợp BA + IBA đến khả năng nảy mầm và sinh trưởng của hạt nhân tạo.
Bảng 3.19 Ảnh hưởng của BA, tổ hợp BA + IBA đến khả năng nảy mầm và sinh trưởng của hạt nhân tạo
(sau 12 tuần nuôi cấy)
Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ IBA (mg/l) Tỷ lệ nảy mầm (%) Số chồi/ hạt Chiều cao chồi (mm) Tỷ lệ ra rễ (%) Số rễ /hạt NT HV NT HV NT HV NT HV NT HV 0,0 - 70,0 76,0 2,1 2,0 8,5 9,8 43,0 42,0 2,9 2,8 0,5 - 78,0 80,0 2,3 2,5 9,0 10,2 45,0 46,0 3,0 3,2 1,0 - 80,0 83,0 3,0 3,6 9,6 11,5 50,0 51,0 2,3 3,5 1,5 - 83,0 88,0 4,8 5,2 10,5 12,3 52,0 55,0 3,4 3,6 2,0 - 89,0 92,0 5,4 6,4 10,6 12,8 66,0 70,0 3,6 3,9 2,5 - 81,0 84,0 4,6 5,1 9,3 11,8 60,0 58,0 2,0 2,8 CV (%) 3,6 3,0 3,3 2,3 3,1 2,7 LSD0,05 0,44 0,77 0,56 0,40 0,31 0,36 2,0 0,5 96,0 98,0 7,6 8,0 13,0 14,2 88,0 88,0 4,1 4,0 2,0 1,0 92,0 93,0 7,2 7,6 11,2 11,6 66,0 62,4 3,6 3,5 2,0 1,5 82,0 81,0 6,9 7,0 9,8 11,0 60,5 58,2 3,0 3,2 2,0 2,0 72,0 79,0 5,6 5,3 8,6 9,2 56,2 55,0 2,9 3,0 2,0 2,5 68,0 77,0 4,8 4,6 8,0 8,7 48,6 41,2 2,2 2,6 CV (%) 3,3 2,3 3,2 3,1 3,1 2,2 LSD 0,05 0,64 1,20 0,40 2,29 0,28 0,14
Kết quả ở bảng 3.19 cho thấy: bổ sung BA và tổ hợp BA + IBA vào dung dịch 3% sodium alginate đã có tác dụng tốt đến tỷ lệ nảy mầm của hạt sau 12 tuần cho cả
hai loài lan nghiên cứu.
Tỷ lệ hạt nảy mầm ở cả hai loài lan đạt cao nhất ở nồng độ 2 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA (96% với lan Nghệ tâm; 98% với lan Hạc vỹ) cao hơn khá nhiều so với đối chứng không bổ sung (70% với lan Nghệ tâm; 76% với lan Hạc vỹ).
Cùng với việc làm tăng tỷ lệ hạt nảy mầm, tổ hợp 2 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA cũng có tác động tốt đến các chỉ tiêu số chồi, chiều cao chồi, tỷ lệ ra rễ và số rễ/hạt của cây con (các giá trị tương ứng là 7,6 chồi/hạt,13 mm, 88% và 4,1 rễ/hạt đối với lan Nghệ tâm và 8 chồi/hạt, 14,2 mm, 88% và 4 rễ/hạt với lan Hạc vỹ, cao hơn hẳn các công thức xử lý khác.
3.2.6 Nghiên cứu kỹ thuật bảo quản hạt nhân tạo
3.2.6.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian bảo quản của hạt nhân tạo
Một số cơng trình nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng nảy mầm của hạt nhân tạo lan sau thời gian bảo quản trên các đối tượng Coelogyne breviscapa Lindl (Mohanraj et al., (2009); lan Flickingeria nodosa (Dalz.) Seidenf (Nagananda
et al., 2011); lan Cymbidium aloifolium (L.) Sw (Shreeti Pradhan et al.,(2014) đã chỉ
ra rằng bảo quản ở 4°C hạt có khả năng nảy chồi và ra rễ tốt nhất.
Q trình thí nghiệm ở các dải nhiệt độ khác nhau (0, 4, 8, 12, 16, 20, 25°C), chúng tôi nhận thấy các mức 0, 4 và 25°C có tác động rõ nét đến khả năng nảy mầm và sinh trưởng của hạt nhân tạo, vì thế được chọn làm yếu tố thí nghiệm, kết quả được trình bày ở bảng 3.20.
Bảo quản hạt ở 4°C có hiệu quả hơn so với bảo quản hạt ở 0°C và 25°C. Khả năng nảy mầm của hạt nhân tạo giảm dần theo thời gian bảo quản. Ðiều này có lẽ do lớp vỏ bọc gây nên tình trạng khơng thống khí, ảnh hưởng đến khả năng hơ hấp của hạt mặc dù là phôi vẫn ở trạng thái hoạt động (De., 2007).Khi bảo quản hạt nhân tạo