CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái hai loài lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum)
- Các mẫu giống được đánh giá ở giai đoạn cây trưởng thành. Mơ tả hình thái theo phương pháp nghiên cứu thực vật học (Nguyễn Nghĩa Thìn, 2007) bao gồm các đặc điểm, thân, lá, hoa và cấu tạo hoa,…
- Phân tích mẫu giống và xác định tên lồi theo phương pháp so sánh hình thái dựa trên các tài liệu Hoa lan Việt Nam (Trần Hợp, 1998), Thực vật chí Việt Nam (Dương Đức Huyến, 2007).
2.3.2 Phương pháp nghiên cứu cấu tạo vi phẫu hai loài lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum)
Đặc điểm vi phẫu rễ, thân, lá được đánh giá theo phương pháp cải tiến của Nguyễn Nghĩa Thìn (2007). Mẫu rễ, thân, lá tươi được cố định trong cồn 700 cho đến khi loại hết diệp lục trong mơ. Sau đó rửa bằng nước cất, rồi cắt thành các lát cắt mỏng từ 1 đến vài lớp tế bào bằng dao lam. Đối với mẫu thân, các lát cắt được cắt vng góc qua thân, còn đối với mẫu lá, các lát cắt được cắt vng góc với gân chính tại vị trí chính giữa phiến lá. Sau khi cắt xong, chọn các lát cắt có độ mỏng đem tẩy trong nước javel cho hết các tạp chất trong mô, rồi nhuộm trong dung dịch carmin- phèn chua 3%, thời gian 24 giờ, sau đó rửa 3 lần bằng nước cất rồi nhuộm tiếp bằng xanhmethylen 0,01% trong 10 phút, rửa 3 lần bằng nước cất và bảo quản trong glycerin. Làm tiêu bản giọt ép, quan sát các lát cắt và đo, đếm các chỉ tiêu giải phẫu sử dụng kính hiển vi với thị kính có gắn trắc vi, đo đếm trên 30 lát cắt được lựa chọn ngẫu nhiên của giống. Chụp ảnh bằng máy ảnh Sony DSC - HX7V.
2.3.3 Phương pháp phân tích một số thành phần hóa sinh cơ bản của lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum )
Mẫu phân tích dược tính: Tồn bộ cây được rửa sạch và sấy khơ cịn độ ẩm < 13 %, bảo quản ở nhiệt độ phịng.
- Xác định hàm lượng alkaloids tồn phần: theo phương pháp acid - base (Dược điển
Việt Nam IV, 2009).
- Xác định hàm lượng flavonoids toàn phần: theo phương pháp đo quang UV- VIS. (Mudasir Sultana et al., 2012).
- Xác định hàm lượng polysaccharids toàn phần: theo phương pháp đo quang UV- VIS. (Dược điển Trung Quốc, 2010).
- Xác định hàm lượng chất khoáng (Ca, Mg, Fe): theo phương pháp quang phổ hấp thu nguyên tử (AAS).
2.3.4 Phương pháp nghiên cứu nhân giống in vitro và tạo hạt giống nhân tạo
2.3.4.1 Phương pháp lấy mẫu, khử trùng mẫu cấy
Chọn các chồi non có chiều dài 7 - 10 cm được tách ra từ cây mẹ khỏe mạnh, không bị sâu bệnh, rửa sạch bằng nước xà phòng, rồi ngâm trong dung dịch 0,1% streptomycin trong 2 phút và rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3 lần. Tiếp theo khử trùng mẫu với NaOCl, cefotaxime sau đó rửa lại bằng nước cất vơ trùng 5 lần mỗi lần 5 phút. Các mẫu sau khi khử trùng, bóc tách lá bao, cắt lấy các đỉnh sinh trưởng kích thước 0,5 - 1,0 cm, rồi cấy trên môi trường VW + 20 g/l sucrose + 10 % nước dừa + 7 g/l agar. Số mẫu đưa vào khử trùng 30 mẫu/lồi/cơng thức.
- Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng NaOCl và thời gian khử trùng lên mẫu cấy
CT1: 3 % NaOCl trong 5 phút CT4: 3 % NaOCl trong 20 phút CT2: 3 % NaOCl trong 10 phút CT5: 3 % NaOCl trong 25 phút CT3: 3 % NaOCl trong 15 phút CT6: 3 % NaOCl trong 30 phút - Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng cefotaxime tới tỷ lệ sống vô trùng của mẫu cấy
CT1 (Đ/C): 3% NaOCl trong 15 phút CT3: Đ/C + 1‰ cefotaxime CT2: Đ/C + 0,5‰ cefotaxime CT4: Đ/C + 1,5‰ cefotaxime
CT5: Đ/C + 2‰ cefotaxime
2.3.4.2 Phương pháp nghiên cứu cảm ứng protocorm like bodies từ lát mỏng tế bào nằm ngang (tTCL)
Chồi in vitro được lấy từ chồi nảy mầm của đỉnh sinh trưởng được nuôi cấy trên mơi trường VW có kích thước 1 - 2 cm, cắt chồi thành những lát mỏng theo chiều ngang (tTCL) 1,0 - 1,5 mm. Lát mỏng tế bào được cấy lên môi trường phát sinh PLBs từ tTCL.
- Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng tạo PLBs lát mỏng tế bào nằm ngang (tTCL)
CT1 (Đ/C): Nền (VW + 20 g/l sucrose + 10 % nước dừa+ 7 g/l agar)
CT2: Nền + 0,5 mg/l BA CT5: Nền + 2,0 mg/l BA
CT3: Nền + 1,0 mg/l BA CT6: Nền + 2,5 mg/lBA
CT4: Nền + 1,5 mg/l BA CT7: Nền + 3,0 mg/l BA
- Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp (BA + αNAA) đến khả năng
tạo PLBs lát mỏng tế bào nằm ngang (tTCL)
CT1 (Đ/C): Nền (VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar + 1,5 mg/l BA) CT2: Nền + 0,5 mg/l αNAA CT4: Nền + 1,5 mg/l αNAA
CT3: Nền + 1,0 mg/l αNAA CT5: Nền + 2,0 mg/l αNAA
2.3.4.3 Phương pháp tái sinh chồi từ protocorm like bodies
Các PLBs thu được từ thí nghiệm phát sinh PLBs có chất lượng tốt, được tách thành cụm nhỏ có kích thước khoảng 3 - 4 mm, được cấy lên môi trường phát sinh chồi từ PLBs.
- Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp (BA + IBA) đến khả năng tái sinh chồi từ PLBs
CT1 (Đ/C): Nền (VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar + 1,0 g/l than hoạt tính + 2 g/l peptone + 1,5 mg/l BA)
CT2: Nền + 0,5 mg/l IBA CT4: Nền + 1,5 mg/l IBA CT3: Nền + 1,0 mg/l IBA CT5: Nền + 2,0 mg/l IBA
- Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nghiền bí ngơ đến khả năng tái sinh chồi từ PLBs
CT1 (Đ/C): Nền (VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar + 1,0 g/l than hoạt tính + 2 g/l peptone + 1,5 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA)
CT2: Nền + 10 g/l dịch nghiền bí ngơ CT5: Nền + 40 g/l dịch nghiền bí ngơ CT3: Nền + 20 g/l dịch nghiền bí ngơ CT6: Nền + 50 g/l dịch nghiền bí ngơ CT4: Nền + 30 g/l dịch nghiền bí ngơ
- Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của tảo Spirulina đến khả năng tái sinh
chồi từ PLBs
CT1 (Đ/C): Nền (VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar + 1,0 g/l than hoạt tính + 2 g/l peptone + 1,5 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA+ 30 g/l dịch nghiền bí ngơ)
CT2: Nền + 1 g/l tảo Spirulina CT4: Nền + 3 g/l tảo Spirulina CT3: Nền + 2 g/l tảo Spirulina
2.3.4.4 Phương pháp nghiên cứu tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Các chồi sau khi thu được ở các thí nghiệm trên có kích thước chiều cao khoảng 2 - 3 cm, 2 - 3 lá, được cấy chuyển sang mơi trường tạo cây hồn chỉnh
- Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi CT1 (Đ/C): Nền (VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar + 1 g/l than hoạt tính, pH 5,5)
CT2: Nền + 0,5 mg/l IBA CT4: Nền + 1,5 mg/l IBA CT3: Nền + 1,0 mg/l IBA CT5: Nền + 2,0 mg/l IBA
- Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của PAA đến khả năng tạo rễ của chồi CT1 (Đ/C): Nền (VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar + 1,0 g/l than hoạt tính, pH 5,5)
CT2: Đ/C + 0,5 mg/l PAA CT4: Đ/C + 1,5 mg/l PAA CT3: Đ/C + 1,0 mg/l PAA CT5: Đ/C + 2,0 mg/l PAA
2.3.4.5 Phương pháp tạo hạt giống nhân tạo và bảo quản hạt nhân tạo
mg/l BA + 7 g/l agar, pH 5,5, cắt PLBs với kích thước 3 - 4 mm để làm nguyên liệu tạo hạt nhân tạo.
Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo
- Thí nghiệm 10: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate (%) và CaCl2.2H2O (mM) khác nhau đến khả năng tạo hạt và nảy mầm của hạt nhân tạo Dùng pipette nhỏ từng giọt dung dịch sodium alginate với các nồng độ khác nhau (2 - 4%) chứa PLBs vào dung dịch CaCl2.2H2O có các nồng độ (75 - 125 mM) trong thời gian 30 phút để tạo vỏ cứng cho hạt. Sau đó các hạt được rửa lại 3 lần nước cất vơ trùng. Quan sát hình dạng và độ cứng của các hạt tạo thành, chọn những hạt có kích thước đồng đều, trịn, trong, chắc để khảo sát khả năng nảy mầm của hạt khi nuôi cấy trên môi trường cơ bản VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar + 1 g/l THT.
- Thí nghiệm 11: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với dung dịch CaCl2.2H2O đến khả năng nảy mầm của hạt nhân tạo
Dùng pipette nhỏ từng giọt dung dịch sodium alginate nồng độ 3% chứa PLBs vào dung dịch CaCl2.2H2O 100 mM + MS, để các hạt trong dung dịch này ở thời gian khác nhau (10 - 40 phút) để tạo lớp vỏ hạt. Sau đó các hạt được tái sinh trên môi trường cơ bản VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar + 1 g/l THT.
- Thí nghiệm 12: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA, BA + IBA đến khả năng nảy mầm và sinh trưởng của hạt nhân tạo
Dùng pipette nhỏ từng giọt dung dịch sodium alginate nồng độ 3% bổ sung BA (0,0 - 2,5) và 2 mg/l BA + (0,0 - 2,5 mg/l) IBA + MS chứa PLBs cho vào dung dịch CaCl2.2H2O 100 mM trong 30 phút. Sau đó các hạt được nuôi cấy trên môi trường cơ bản VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar + 1 g/THT.
Nghiên cứu kỹ thuật bảo quản hạt nhân tạo
- Thí nghiệm 13: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian bảo quản của hạt nhân tạo
Dùng pipette nhỏ từng giọt dung dịch sodium alginate nồng độ 3% bổ sung 2 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA + MS chứa PLBs cho vào dung dịch CaCl2.2H2O 100 mM trong 30 phút. Hạt nhân tạo được bảo quản trong dung dịch MS, pH 5,5. Các
bình đặt ở (0; 4; 16; 25°C) trong điều kiện tối. Sau thời gian bảo quản các hạt được nuôi cấy trên môi trường cơ bản VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar + 1 g/l THT.
- Thí nghiệm 14: Nghiên cứu ảnh hưởng của ABA đến thời gian bảo quản của hạt nhân tạo
Dùng pipette nhỏ từng giọt dung dịch sodium alginate nồng độ 3% + 2 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA + 20 g/l sucrose + 1 g/l THT bổ sung ABA với các nồng độ khác nhau (10 - 30 mg/l) + MS chứa PLBs cho vào dung dịch CaCl2.2H2O 100 mM trong 30 phút. Sau thời gian bảo quản các hạt được nuôi cấy trên môi trường cơ bản VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar + 1g/l THT. Thí nghiệm được đặt ở 4°C trong điều kiện tối.
- Thí nghiệm 15: Nghiên cứu ảnh hưởng của natri benzoat, carbendazim và topsin - M đến khả năng bảo quản hạt nhân tạo
Dùng pipette nhỏ từng giọt dung dịch sodium alginate nồng độ 3% + 2 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA + 20 g/l sucrose + 1 g/l THT bổ sung natri benzoat (1 - 4 mg/l), topsin - M (1 - 4 mg/l), carbendazim (1000 - 4000 mg/l) + MS chứa PLBs cho vào dung dịch CaCl2.2H2O 100 mM trong 30 phút. Sau thời gian bảo quản các hạt được nuôi cấy trên môi trường cơ bản VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar + 1 g/l THT.
2.3.4.5 Phương pháp nhân nhanh in vitro từ hạt nhân tạo sau quá trình bảo quản
- Thí nghiệm 16: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp (BA + PAA) đến khả năng
nhân nhanh protocorm và chồi.
Các hạt nhân tạo sau khi bảo quản được cấy trên môi trường VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar + 1 g/l THT + 1,5 mg/l BA kết hợp với các nồng độ (0,5 - 2 mg/l) PAA.
- Thí nghiệm 17: Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nghiền cà chua đến khả năng nhân nhanh protocorm và chồi.
Các hạt nhân tạo sau khi bảo quản được cấy trên môi trường (VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar + 1 g/l THT+ 1,5 mg/l BA + 0,5 mg/l PAA), kết hợp với (10 - 100 g/l) dịch nghiền cà chua.
2.3.4.6 Phương pháp tạo cây in vitro hoàn chỉnh từ hạt nhân tạo sau quá trình bảo quản
- Thí nghiệm 18: Nghiên cứu ảnh hưởng của PAA đến khả năng tạo cây in vitro
hoàn chỉnh sau bảo quản
Khi các chồi đạt chiều cao 2 - 3 cm, chưa có rễ, chồi màu xanh được tách ra và cấy chuyển sang mơi trường tạo cây hồn chỉnh VW + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 7 g/l agar + 1 g/l THT, PAA (0,5 - 2 mg/l). Thời gian theo dõi thí nghiệm sau 6 tuần nuôi cấy.
2.3 Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc cây con lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) in vitro giai đoạn vườn ươm
Các cây in vitro từ hạt nhân tạo sau khi ni cấy trong phịng thí nghiệm đạt chiều cao 5 - 6 cm, có 4 - 6 lá và 3 - 5 rễ, để bình cây ra ngồi vườn ươm 7 ngày sau đó tiến hành ra cây. Các cây được rửa hết thạch, rải đều trên khay sạch để trong 4 giờ, khử trùng cây trong dung dịch 3 g/l carbendazim trong 5 phút rồi trồng vào các giá thể khác nhau.
Các thí nghiệm 19, 20 bố trí tuần tự 1 lần khơng nhắc lại, các thí nghiệm 21, 22 bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCBD) với 3 lần nhắc lại. Giai đoạn vườn ươm mỗi cơng thức thí nghiệm 150 cây, 10 cây/chậu, kích thước chậu (8 x 12 cm). Theo dõi đo đếm các chỉ tiêu sinh trưởng, phát triển của 30 cây/cơng thức thí nghiệm. Đánh giá thí nghiệm sau 3 tháng và số liệu được theo dõi 30 ngày/lần.
Thí nghiệm 21, 22 được trồng vào vụ Thu 18/8/2016 - 18/10/2016.
Thí nghiệm 22 giá thể cho lan Nghệ tâm rêu + đá bọt (50:50) và lan Hạc vỹ rêu : xơ dừa (70:30), phun Growmore (30:10:10), với liều lượng 1 g/l, phun 7 ngày/lần, phun sau trồng 1 tháng, lượng 0,5 lít dung dịch cho 2 m2/100 cây.
- Thí nghiệm 19: So sánh khả năng sinh trưởng của cây nhân giống in vitro truyền
thống và cây nhân giống in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản ở giai đoạn vườn ươm
Thí nghiệm gồm 2 cơng thức
CT1: Cây nhân giống in vitro truyền thống
Sử dụng giá thể rêu và phun Growmore (30:10:10), liều lượng phun 1 g/l, phun 7 ngày/lần, phun sau trồng 1 tháng, lượng 0,5 lít dung dịch cho 1 m2/5 chậu.
- Thí nghiệm 20: Nghiên cứu xác định thời vụ ra ngôi cây con in vitro giai đoạn vườn ươm
Thí nghiệm gồm 4 công thức:
CT1: Vụ Thu (trồng 18/08/2016) CT3: Vụ Xuân (trồng 18/02/2017) CT2: Vụ Đông (trồng 18/11/2016) CT4: Vụ Hè (trồng 18/05/2017) Giá thể trồng là rêu và phun Growmore (30:10:10), liều lượng phun 1 g/l, phun 7 ngày/lần, phun sau trồng 1 tháng, lượng 0,5 lít dung dịch cho 1 m2/5 chậu. - Thí nghiệm 21: Nghiên cứu xác định giá thể cho cây con in vitro giai đoạn vườn ươm
Thí nghiệm gồm 4 cơng thức
CT1: Rêu CT3: Rêu + đá bọt (50:50) CT2: Xơ dừa CT4: Rêu + xơ dừa (70:30)
- Thí nghiệm 22: Nghiên cứu bổ sung chế phẩm dinh dưỡng cho cây con in vitro giai đoạn vườn ươm
Thí nghiệm gồm 4 cơng thức:
CT1: Đối chứng (Phun nước lã) CT3: Phun B1Thái Lan
CT2: Phun Đầu trâu 502 (30:12:10) CT4: Phun Growmore (30:10:10) Chế phẩm dinh dưỡng được phun định kỳ 7 ngày/lần, Đầu trâu 502 và Growmore (30:10:10) phun liều lượng 1 g/l, B1Thái Lan phun 2 ml/l, lượng 0,5 lít dung dịch cho 1 m2/5 chậu.
2.4 Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) giai đoạn vườn sản suất
Cây lan được 3 tháng tuổi có chiều cao cây 6 - 7 cm, có 6 - 7 lá bắt đầu chuyển chậu và trồng trên các loại giá thể khác nhau. Các thí nghiệm bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCBD) với 3 lần nhắc lại. Giai đoạn vườn sản xuất mỗi cơng thức thí
trưởng, phát triển của 30 cây/cơng thức thí nghiệm. Đánh giá thí nghiệm sau 6 tháng