Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Mẫu tôm sú
* Các mẫu tôm sú sử dụng cho nghiên cứu đa hình AFLP do Viện Nghiên cứu NTTS I (Đình Bảng - Từ Sơn - Bắc Ninh) cung cấp. Mẫu được thu từ 3 quần đàn tự nhiên khác nhau: Quần đàn Bắc Trung Bộ (kí hiệu: BTB) thu mẫu tại vùng biển tỉnh Nghệ An, Quần đàn Nam Trung Bộ (NTB) thu mẫu tại vùng biển tỉnh Khánh Hòa và Quần đàn Nam Bộ (NB) thu mẫu tại vùng biển tỉnh Bạc Liêu. Mỗi quần đàn thu trên 50 mẫu.
* Các mẫu tôm sú sử dụng cho nghiên cứu sàng lọc chỉ thị phân tử (SNP) do Viện Nghiên cứu NTTS II (116 Nguyễn Đình Chiểu, Quận 1, Tp. Hồ Chí Minh) cung cấp. Vật liệu gốc (Bảng 2.1) bao gồm bốn dịng tơm sú bố mẹ (khối lượng >100 gam/con) có nguồn gốc địa lý khác nhau, trong đó ba dịng có nguồn gốc tự nhiên là tôm sú Ấn Độ Dương (kí hiệu: A) nhập từ Thái Lan (vùng biển Amanda) và từ Myanmar, tơm sú Thái Bình Dương (T) nhập từ Singapore, tơm tự nhiên của Việt Nam (thu thập từ Cà Mau, Đà Nẵng, Phú Yên) - gọi chung là tơm nội địa (N), nhóm thứ tư là dịng tơm Gia hóa (G) được cung cấp bởi Công ty Moana Ninh Thuận - Đây là tơm chọn giống được thương mại hóa dùng làm tôm bố mẹ sản xuất tôm giống phục vụ cho ni thương phẩm. Các gia đình tơm sú (thế hệ Go và G1) được sinh ra từ các đàn tôm bố mẹ này bằng cách phối ghép hỗn hợp giữa bốn dịng tơm bố mẹ.
Từ các cá thể trong đàn con của các gia đình tơm sú thế hệ Go và G1, chọn ra các cá thể (bao gồm cả tôm cái - ♀ và tơm đực - ♂) thuộc hai nhóm khác nhau theo tiêu chí mức độ tăng trưởng: tăng trưởng nhanh (Fast - F) và tăng trưởng chậm (Slow - S) để sử dụng cho nghiên cứu sàng lọc SNP (Bảng 2.2).
* Các mẫu tôm sú sử dụng cho nghiên cứu đánh giá tôm tăng trưởng nhanh bằng kỹ thuật PCR đặc hiệu alen cạnh tranh (KASP): Bao gồm 40 mẫu tôm sú cái
tăng trưởng nhanh thế hệ G1 do Viện Nghiên cứu NTTS II cung cấp.
Bảng 2.1. Số lượng cá thể thu thập được của bốn dịng tơm sú sử dụng làm vật liệu gốc (tôm bố mẹ)
Dịng tơm Số lượng
Tổng số Tôm cái Tôm đực
Ấn Độ Dương (A) 76 71 147
Thái Bình Dương (T) 86 58 144
Nội địa (N) 236 186 422
Gia hóa (G) 62 61 123
Tổng số: 460 376 836
Bảng 2.2. Các nhóm tơm sú sử dụng cho nghiên cứu sàng lọc SNP
Kí hiệu nhóm tơm Thế hệ Tính trạng tăng trưởng Số lượng cá thể Tổng số (♀ , ♂) I Go Nhanh (F) 60 (30, 30) II Chậm (S) 60 (30, 30) III G1 Nhanh (F) 60 (30, 30) IV Chậm (S) 60 (30, 30) 2.1.2. Hóa chất
Hóa chất bảo quản mẫu tôm: ethanol 95 - 100% (Sigma Aldrich)
Hóa chất tách chiết DNA tổng số: Nitơ lỏng, dung dịch phá tế bào (Lysis buffer: EDTA 100 mM, Tris-HCl 10 mM pH 8 và proteinase K (1 mg/ml)), dung dịch PCI (Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol tỷ lệ 25:24:1), dung dịch CI (Chloroform:Isoamyl alcohol tỷ lệ 24:1), isopropanol, ethanol, 1X TE buffer (20 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0, nuclease-free), RNase; Kit tách chiết DNA tổng số (Qiagen/Invitrogen).
Kit tinh sạch DNA tổng số: PureLink™ Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies). Thành phần và hàm lượng của 01 bộ kit tinh sạch đủ dùng cho 10 mẫu như sau:
- PureLinkTM Genomic Lysis/Binding Buffer (2 ml) - PureLinkTM Genomic Digestion Buffer (1,8 ml)
- PureLinkTM Genomic Wash Buffer 1 (2 ml) - PureLinkTM Genomic Wash Buffer 2 (1,5 ml)
- PureLinkTM Genomic Elution Buffer (2 ml) (10 mM Tris-HCl; pH 9,0; 0,1 mM EDTA)
- RNase A (20mg/ml) trong 50mM Tris-HCl; pH 8,0; 10mM EDTA (0,4 ml) - Proteinase K (20 mg/ml) trong đệm chứa (0,2 ml)
- PureLinkTM Spin Columns (10 chiếc)
- PureLinkTM Collection Tubes loại 2,0 ml (20 chiếc)
Hóa chất điện di DNA (Fermentas, Sigma Aldrich, Promega...): Agarose; Dung dịch đệm TE (Tris-EDTA) 1X; Dung dịch đệm tra mẫu: 0,09% bromophenol blue; 0,09% xylene xyanol (FF); 60% glycerol; Thang DNA chuẩn (Fermentas); Dung dịch nhuộm ethidium bromide 0,1 mg/ml.
Hóa chất thực hiện kỹ thuật AFLP (Invitrogen - Mỹ): - Thang DNA chuẩn 1 kb Plus (ThermoFisher) - Hóa chất dùng cho phản ứng cắt và gắn adaptor:
+ Enzym master mix: EcoRI 500U; MseI 100U; T4 DNA ligase buffer 5X
with ATP; NaCl 0,5M loại dùng cho sinh học phân tử; Bovine serum albumin (BSA) 1,0 mg/mL nuclease-free; T4 DNA ligase 100U);
+ MseI adaptor và EcoRI adaptor có trình tự như sau:
MseI adaptor EcoRI adaptor 5'-GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT-5' 5'-CTCGTAGACTGCGTACC CTGACGCATGGTTAA-5'
- Hóa chất dùng cho phản ứng khuếch đại tiền chọn lọc (preselective): AFLP® Ligation and Preselective Amplification Kit (AFLP preselective primer; AFLP core mix).
- Hóa chất dùng cho phản ứng khuếch đại chọn lọc (selective): Mse I-CTT 5µM; EcoR I-ACG JOE 1 àM; AFLPđ Amplification Core Mix.
Invitrogen).
Bng 2.3. Thành phần các mồi sử dụng trong kỹ thuật AFLP
EcoRI (5’ - 3’) MseI (5’ - 3’)
Mồi tiền chọn lọc EcoRI adaptor + EcoRI + A MseI adaptor + MseI + C
Mồi chọn lọc EcoRI-ACC JOE MseI-CTT
Hóa chất phân tích AFLP trên máy xác định trình tự tự động sử dụng điện di mao quản ABI 3100 (Invitrogen):
- Dung dịch đệm tra mẫu (Loading buffer mix): 1,25 µL deionized formamide (Hi-Di™ Formamide); 0,25 µL blue dextran/25 mM EDTA loading solution; 0,5 µL GeneScan-500 [ROX] size standard.
- Hóa chất dùng cho điện di mao quản: 6% denaturing polyacrylamide gel; 3100 POP-7™ Polymer, 10X 3130 Genetic Analyzer Buffer with EDTA, GeneScan™- 500 ROX™ dye-labeled Size Standard.
Hóa chất đánh dấu cá thể tôm nuôi: Phẩm màu huỳnh quang (VIE) Hóa chất sát khuẩn: Povidone iodine 20 ppm
Hóa chất thực hiện kỹ thuật GBS:
- Chất nhuộm màu PicoGreen® (Invitrogen, Carlsbad, CA);
- Enzyme cắt hạn chế: ApeKI (New England Biolabs, Ipswitch, MA) - Trình tự các adaptor:
Barcode adaptor:
5′-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTxxxx
5′-CWGyyyyAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT
Common adaptor có một đầu đính phù hợp với trình tự vị trí cắt của enzyme
ApeKI:
5′-CWGAGATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG 5′-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT
- NEB Buffer
đơn vị đầu đính) (New England Biolabs).
- Hóa chất tinh sạch thư viện DNA: QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) - Hóa chất thực hiện phản ứng PCR: 1× Taq Master Mix (New England Biolabs), Trình tự mồi: (A)5′AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT (B)5′CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAA CCGCTCTTCCGATCT.
Hóa chất thực hiện kỹ thuật KASP:
- KASP Assay mix, gồm: hai mồi xuôi đặc hiệu với alen chứa SNP, mồi có gắn trình tự đi đặc trưng, trong đó: một mồi đặc hiệu alen kiểu dại có đầu 5’ bắt cặp bổ sung với mẫu dò gắn chất phát quang HEX màu đỏ (HEX allele) và một mồi đặc hiệu allen kiểu đột biến có đầu 5’ bắt cặp bổ sung với mẫu dò gắn chất phát quang FAM màu xanh dương (FAM allele); một mồi ngược. Trình tự các mồi như sau:
Trình tự mồi xi allele kiểu dại (gắm HEX-tail):
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGCAGAGCTCCTTCGGCC-3’
Trình tự mồi xi allele kiểu đột biến (gắn FAM-tail):
5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGCACGCATCTTGGTCTTCTCC-3’
Trình tự mồi ngược: 5’-CGCACGCATCTTGGTCTTCTCC-3’
- KASP Master mix (Hãng LGC Genomics), gồm: FAM™ và HEX™ specific FRET cassette; Taq polymerases; Đệm (Optimised buffer).
Thành phần bộ Kit (Hãng LGC Genomics) gồm: KASP Master mix (2x), MgCl2 (50 mM), DMSO.
2.1.3. Thiết bị
Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu thuộc Phòng Vi sinh vật học phân tử và Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ gen, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (Bảng 2.4).
Bảng 2.4. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Tên thiết bị Hãng sản xuất
Máy quang phổ NanoDrop® Spectrophotometer ThermoScientific Máy xác định trình tự tự động ABI PRISM 3100 Applied BioSystems Máy PCR (GeneAmp PCR System 9700) Applied BioSystems Máy giải trình tự Illumina NextSeq500 Illumina, Inc. Máy ly tâm 5415 R, 5415 C (Table Centrifuge) Eppendorf Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320) Mettler Toledo Máy làm khô chân không (Speed Vacuum Sc 110A) Savant
Máy soi DNA-UV-Transilluminator Vilber Lourmat Máy chụp ảnh Gel - Doc Applied BioSciences
Máy ảnh Sony
Tủ -20o
C, -80oC Sanyo
Lị vi sóng (microwave) Samsung
Cân phân tích (Analytic balances) Mettler Toledo Cân điện tử (Electronic balances) Ohaus
Pippetman các loại Gilson
Vortex OSI Rotolab
Bể ổn nhiệt Tempette Junior Techne
Thiết bị điện di
Các dụng cụ và thiết bị thông thường khác của phịng thí nghiệm (eppendorf tube các loại, cối chày sứ, dao kéo cắt mẫu, giấy thấm...)