EcoRI (5’ - 3’) MseI (5’ - 3’)
Mồi tiền chọn lọc EcoRI adaptor + EcoRI + A MseI adaptor + MseI + C
Mồi chọn lọc EcoRI-ACC JOE MseI-CTT
Hóa chất phân tích AFLP trên máy xác định trình tự tự động sử dụng điện di mao quản ABI 3100 (Invitrogen):
- Dung dịch đệm tra mẫu (Loading buffer mix): 1,25 µL deionized formamide (Hi-Di™ Formamide); 0,25 µL blue dextran/25 mM EDTA loading solution; 0,5 µL GeneScan-500 [ROX] size standard.
- Hóa chất dùng cho điện di mao quản: 6% denaturing polyacrylamide gel; 3100 POP-7™ Polymer, 10X 3130 Genetic Analyzer Buffer with EDTA, GeneScan™- 500 ROX™ dye-labeled Size Standard.
Hóa chất đánh dấu cá thể tôm nuôi: Phẩm màu huỳnh quang (VIE) Hóa chất sát khuẩn: Povidone iodine 20 ppm
Hóa chất thực hiện kỹ thuật GBS:
- Chất nhuộm màu PicoGreen® (Invitrogen, Carlsbad, CA);
- Enzyme cắt hạn chế: ApeKI (New England Biolabs, Ipswitch, MA) - Trình tự các adaptor:
Barcode adaptor:
5′-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTxxxx
5′-CWGyyyyAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT
Common adaptor có một đầu đính phù hợp với trình tự vị trí cắt của enzyme
ApeKI:
5′-CWGAGATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG 5′-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT
- NEB Buffer
đơn vị đầu đính) (New England Biolabs).
- Hóa chất tinh sạch thư viện DNA: QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) - Hóa chất thực hiện phản ứng PCR: 1× Taq Master Mix (New England Biolabs), Trình tự mồi: (A)5′AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT (B)5′CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAA CCGCTCTTCCGATCT.
Hóa chất thực hiện kỹ thuật KASP:
- KASP Assay mix, gồm: hai mồi xuôi đặc hiệu với alen chứa SNP, mồi có gắn trình tự đi đặc trưng, trong đó: một mồi đặc hiệu alen kiểu dại có đầu 5’ bắt cặp bổ sung với mẫu dò gắn chất phát quang HEX màu đỏ (HEX allele) và một mồi đặc hiệu allen kiểu đột biến có đầu 5’ bắt cặp bổ sung với mẫu dò gắn chất phát quang FAM màu xanh dương (FAM allele); một mồi ngược. Trình tự các mồi như sau:
Trình tự mồi xi allele kiểu dại (gắm HEX-tail):
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGCAGAGCTCCTTCGGCC-3’
Trình tự mồi xi allele kiểu đột biến (gắn FAM-tail):
5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGCACGCATCTTGGTCTTCTCC-3’
Trình tự mồi ngược: 5’-CGCACGCATCTTGGTCTTCTCC-3’
- KASP Master mix (Hãng LGC Genomics), gồm: FAM™ và HEX™ specific FRET cassette; Taq polymerases; Đệm (Optimised buffer).
Thành phần bộ Kit (Hãng LGC Genomics) gồm: KASP Master mix (2x), MgCl2 (50 mM), DMSO.
2.1.3. Thiết bị
Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu thuộc Phòng Vi sinh vật học phân tử và Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ gen, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (Bảng 2.4).