(Nguồn: Elshire et al., 2011) 1. Chuẩn bị mẫu DNA và các adaptor 2. Cắt DNA bằng ApeKI 3. Gắn adaptor 4. Trộn các mẫu và tinh sạch 5. PCR 6. Tinh sạch sản phẩm PCR 7. Đánh giá kích thước các phân đoạn
hai chiều (pair-end) trên hệ thống Illumina NextSeq®500, theo hướng dẫn của nhà sản xuất, sử dụng NextSeq 500/550 High Output v2 Kit (300 chu kỳ).
(2) Xử lý dữ liệu GBS, thiết lập hệ gen tham chiếu tạm thời và xác định SNP
Dữ liệu GBS được xử lý và phân tích để phát hiện các SNP dựa theo phương pháp GBS-SNP-CROP (GBS SNP-Calling Reference Optional Pipeline) được mô tả bởi Melo et al. (2016). Dữ liệu thô được chuyển thành định dạng Fastq bằng công cụ BCL2FASTQ 2.1. Chất lượng trình tự được đánh giá bằng FastQC. Trình tự adaptor được loại bỏ bằng phần mềm Trimmomatic software v.0.3.6 (Bolger et al., 2014). Trình tự của từng mẫu được tách ra trên cơ sở nhận biết trình tự barcode sử dụng cơng cụ In-house script do nhóm nghiên cứu tự phát triển. Do hệ gen tôm sú chưa được cơng bố trình tự tham chiếu nên chúng tơi đã sử dụng các mẫu lắp ráp de
novo để tạo trình tự tham chiếu tạm thời theo phương pháp được mô tả bởi Melo et al. (2016), sử dụng các công cụ PEAR v.0.96 và USEARCH v.8.0.162 (Zhang et al., 2014; Edgar, 2010). Sau khi có trình tự tham chiếu, trình tự của các mẫu tơm sú
được so sánh với trình tự tham chiếu bằng BWA-MEM v.0.7 (Li et al., 2009a). Dữ liệu SNP được truy xuất bằng công cụ SAMtools v.1.2 (Li et al., 2009b). SNP được xác định khi gióng hàng các contig và sự sai khác nucleotide được phát hiện trên ít nhất bốn trình tự. Chỉ các SNP hai allen đáp ứng mức độ lặp lại như trên mới được xác định là SNP (Melo et al., 2016; Nguyễn Minh Thành et al., 2015; Kumar,
2014).
2.2.9. Chú giải các đoạn trình tự và xác định gen liên quan
Cơng cụ BlastX (E-value < 1e-6) được sử dụng để so sánh các contig với cơ sở dữ liệu NCBI non-redundant (Nr-NCBI) nhằm tìm kiếm sự tương đồng giữa các contig cần phân tích với các trình tự protein trên Ngân hàng cơ sở dữ liệu NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) (Jung et al., 2011). Kết quả tìm kiếm được truy xuất dưới dạng danh sách các gen chức năng với các thơng tin về geneID, protein được mã hóa và tên lồi tương ứng. Danh sách này được sử dụng để xác định gen mã hóa protein liên quan đến tăng trưởng ở tôm sú
bằng cách đối chiếu với 22 loại protein đã biết liên quan đến tăng trưởng trong họ giáp xác (Bảng 2.8).
Bảng 2.8. Danh sách 22 loại protein liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở họ giáp xác (Nguồn: Jung et al., 2013)
STT Tên protein STT Tên protein
1 5-Hydroxytryptamine receptor (5-HT) 12 Translin-associated factor X (TRAX) 2 Alpha-amylase 13 Candidate growth genes effect on
moulting
3 Cathepsin L 14 Actin
4 Cyclophilin (Cyps) 15 Crustacean hyperglycaemic hormone (CHH)
5 Fatty acid-binding protein (FANTs) 16 Eyestalk factors
6 Fibrillarin 17 Moult inhibiting hormone (MIH) 7 Glyceradehyde-3-phosphate
dehydrogenase (GAPDH)
18 Candidate muscle build-up or degradation genes involved in moulting
8 Growth hormone and insulin-like growth factor
19 Methyl farnesoate (MF) and
farneosoic acid O-methyltransferase (FAMeT)
9 Myostatin and growth differentiation factor 8/11
20 Heat shock proteins (HSPs)
10 Signal transducer and activator of transcription (STAT)
21 Myosin heavy chain
11 Secreted protein acidic and rich in cysteine (SPARC)
22 Ubiquitin
2.2.10. Xác định trình tự amino acid của contig và đánh giá mức độ tương đồng với gen mã hóa protein quan tâm đồng với gen mã hóa protein quan tâm
Cơng cụ Expasy (http://web.expasy.org) được sử dụng để xác định trình tự amino acid tương ứng với trình tự nucleotide của contig quan tâm bằng cách kiểm tra toàn bộ 6 khung đọc mở 5’3’Frame 1 (+1), 5’3’ Frame 2 (+2), 5’3’ Frame 3 (+3), 3’5’ Frame 1 (-1) , 3’5’ Frame 2 (-2), 3’5’ Frame 3 (-3). Sáu khung đọc mở này tạo ra 6 kiểu trình tự amino acid khác nhau đối với mỗi contig, tiếp tục sử dụng công cụ Uniprot (http://www.uniprot.org) để chọn ra kiểu trình tự amino acid có tỷ lệ tương đồng cao nhất so với trình tự amino acid của protein quan tâm.
2.2.11. Phương pháp KASP
Phương pháp KASP sử dụng bộ Kit của Hãng LGC Genomics. Các bước tiến hành theo quy trình của Hãng (https://www.lgcgroup.com/kasp).
Chỉ thị phân tử SNP liên quan tới tính trạng tăng trưởng nhanh ở tơm sú thuộc gen mã hóa Myosin heavy chain type 1 được sử dụng để kiểm tra trên 40 cá thể tôm sú tăng trưởng nhanh thuộc thế hệ G1 bằng kỹ thuật KASP. Các mồi xuôi và mồi ngược được thiết kế đặc hiệu với trình tự DNA chứa SNP này. Nồng độ DNA mỗi mẫu sử dụng là 50ng. Thí nghiệm bố trí 2 ống đối chứng âm để so sánh.
Thành phần hỗn hợp phản ứng
DNA template (nồng độ 50 ng) 5 µL
2x Master mix 5 µL
Primer mix 0,14 µL
Tổng thể tích 10 µL
(Ở ống đối chứng âm, DNA template được thay thế bằng nước). Chu kỳ nhiệt của phản ứng KASP như sau:
Bảng 2.9. Chu trình nhiệt của phản ứng KASP
94°C trong 15 phút Gia nhiệt 94°C trong 20 giây
61-55°C trong 60 giây (giảm 0.6°C mỗi chu kỳ)
10 chu kỳ
94°C trong 20 giây
55°C trong 60 giây 26 chu kỳ
Kỹ thuật KASP sử dụng các chất phát huỳnh quang FAM và HEX để phân biệt kiểu gen. Các kiểu gen được xác định theo các cụm mẫu thông qua phần mềm phân tích dữ liệu KlusterCaller ™ (Hãng LGC Genomics). Nếu kiểu gen tại một SNP nhất định là đồng hợp tử thì chỉ có một trong hai màu tín hiệu huỳnh quang được tạo ra; Nếu kiểu gen là dị hợp tử thì sẽ tạo ra tín hiệu huỳnh quang hỗn hợp.
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. ĐA HÌNH AFLP Ở CÁC QUẦN ĐÀN TƠM SÚ VIỆT NAM 3.1.1. Kiểm tra hoạt tính cắt DNA của cặp enzyme EcoRI và MseI 3.1.1. Kiểm tra hoạt tính cắt DNA của cặp enzyme EcoRI và MseI
Kết quả điện di các sản phẩm của phản ứng cắt DNA bằng cặp enzyme
EcoRI và MseI trên gel agarose 1,5% cùng với thang DNA chuẩn được thể hiện ở
Hình 3.1.
Kết quả cho thấy cặp enzyme EcoRI và MseI biểu hiện hoạt tính cắt tốt: Các
mẫu DNA tổng số không bị cắt bởi enzyme (giếng 1 và giếng 3) tạo thành các băng đậm trên gel điện di, trong khi các mẫu DNA bị cắt bởi cặp enzyme EcoRI và
MseI (giếng 2 và giếng 4) tạo thành các phân đoạn DNA và tạo thành các vệt dài
(smear) trên bản gel điện di.
Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm của phản ứng cắt DNA bằng cặp enzyme
EcoRI và MseI trên gel agarose 1,5% để kiểm tra hoạt tính của enzyme
M: Thang DNA chuẩn; Giếng (1) và (3): Kết quả điện di các mẫu DNA tổng số; Giếng (2) và (4): Kết quả điện di các sản phẩm của phản ứng cắt bằng enzyme.
8000 bp 1000 bp Thang DNA chuẩn 1kb Plus 5000 bp 4000 bp 3000 bp 2000 bp 1500 bp 850 bp 650 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp M 1 2 3 4
1 µg DNA sau khi cắt bằng cặp enzyme
EcoRI và MseI
1 µg DNA khơng có phản ứng cắt bằng enzyme
3.1.2. Tách DNA tổng số từ tôm sú để thực hiện kỹ thuật AFLP
DNA tổng số từ mô cơ của tất cả các mẫu tôm sú thu được từ 3 quần đàn Bắc Trung Bộ (BTB), Nam Trung Bộ (NTB) và Nam Bộ (NB) đã được tách chiết và tinh sạch qua hai bước: tách thủ công và tinh sạch lại bằng kit. Sau khi xác định nồng độ và độ sạch của các mẫu DNA, 60 trong tổng số 150 mẫu DNA có chất lượng tốt nhất đã được chọn để sử dụng cho các nghiên cứu đánh giá tính đa hình bằng kỹ thuật AFLP ở các thí nghiệm tiếp theo, trong đó: quần đàn BTB: 20 mẫu, quần đàn NTB: 20 mẫu, quần đàn NB: 20 mẫu. Kết quả kiểm tra trên máy Nanodrop cho thấy, tất cả các mẫu đều có độ sạch cao (A260/A280 nằm trong khoảng 1,8 ~ 2,0). Nồng độ các mẫu dao động từ 200 ng/µl tới 400 ng/µl. Nồng độ DNA trung bình của các mẫu tơm sú sử dụng cho kỹ thuật AFLP được trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Nồng độ DNA trung bình của các mẫu tơm sú sử dụng trong kỹ thuật AFLP
Mẫu tơm sú Nồng độ DNA trung bình (ng/µL)
20 mẫu BTB 369,8
20 mẫu NTB 394,7
20 mẫu NB 296,5
Hình ảnh minh họa kết quả điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra DNA tổng số tách chiết từ các mẫu tôm sú được thể hiện ở Phụ lục 10.
3.1.3. Kết quả thực hiện phản ứng tiền chọn lọc
Phản ứng tiền chọn lọc được thực hiện đối với 60 mẫu DNA tổng số có chất lượng tốt nhất (trong số hơn 150 mẫu DNA tách chiết) từ ba quần đàn tôm sú. Sản phẩm của phản ứng tiền chọn lọc được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% (Hình 3.2). Kết quả điện di cho thấy sản phẩm của phản ứng tiền chọn lọc chủ yếu gồm những băng DNA nhỏ có kích thước trong khoảng từ 100 bp đến 1500 bp khi so sánh với thang DNA chuẩn, thể hiện trên hình là vệt sáng (smear) DNA
C