Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.4. Tách chiết, tinh sạch và xác định nồng độ DNA tổng số từ mô cơ tôm sú
DNA tổng số từ mô cơ tôm sú được tách chiết theo quy trình của Eurobiobank (2004) theo các bước chính sau: lấy mẫu ra khỏi dung dịch bảo quản, thấm khô, cân
lấy khoảng 100mg mô cơ thân tôm sú cho vào cối sứ đã khử trùng sạch, rửa mô bằng nước khử trùng và thấm khô, nghiền mô trong nitơ lỏng thành bột mịn; Bổ sung khoảng 300µL dung dịch phá tế bào (lysis buffer), chuyển hỗn hợp vào ống eppendorf sạch, ủ hỗn hợp ở 55oC trong 2 giờ trong bể ổn nhiệt để phá tế bào; Loại bỏ protein bằng cách chiết với dung dịch PCI (tỉ lệ 25 : 24 : 1), sau đó bằng dung dịch CI (tỉ lệ 24 : 1) như sau: bổ sung dung dịch PCI vào hỗn hợp mẫu sau khi ủ theo tỷ lệ 1:1 (v/v), ly tâm 12000 vòng/5 phút, thu dịch nổi (có thể lặp lại bước này), bổ sung dung dịch CI vào dịch nổi thu được theo tỷ lệ 1:1 (v/v), ly tâm 12000 vòng/5 phút, thu dịch nổi (chứa DNA); Tủa DNA bằng dung dịch isopropanol: bổ sung dung dịch isopropanol theo tỷ lệ 1:1 (v/v) và để ở nhiệt độ phòng 15 phút để kết tủa DNA, ly tâm 12000 vòng/20 phút để thu DNA, rửa DNA bằng ethanol 70%, ly tâm 12000 vịng/10 phút thu DNA sạch, làm khơ bằng thiết bị SpeedVac; Hòa tan DNA thu được trong đệm TE (10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA, RNase 10mg/ml); Bảo quản DNA tổng số sau khi tách chiết trong tủ -80oC.
DNA tổng số sau khi tách chiết được tinh sạch bằng Kit PureLinkTM Genomic DNA của hãng Life Technologies theo hướng dẫn của Nhà sản xuất kit; bảo quản DNA sau tinh sạch ở 4oC (trong thời gian ngắn) hoặc ở -20oC (trong thời gian dài).
Nồng độ và độ tinh sạch của DNA sau khi tách chiết được xác định bằng máy quang phổ NanoDrop® Spectrophotometer ở bước sóng λ = 260 nm và λ = 280 nm (Thermo Fisher Scientific - NanoDrop Products, www.nanodrop.com). Cơ sở lý thuyết của phương pháp này (Desjardins & Conklin, 2010) được mô tả ở Phụ lục 5.
2.2.5. Điện di kiểm tra DNA trên gel agarose
Các mẫu DNA sau khi tách chiết và tinh sạch được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. 1 gam agarose được hòa vào 100 mL đệm 1x TE trong lọ pyrex 250 mL có đậy nắp lỏng tay, đun nóng chảy trong lị vi sóng, nhấc ra lắc cho gel hòa đều. Sau khi nhiệt độ của gel hạ xuống khoảng 50oC, gel được đổ vào khuôn điện di đã cài lược sẵn và để yên khoảng 30 phút cho gel đông, đưa gel vào bể điện di vừa đủ ngập trong đệm chạy 1x TE, nhấc lược ra. Mẫu DNA được trộn với đệm nạp và nạp vào giếng. Sau khoảng 45 phút điện di với hiệu điện thế 100V, gel được lấy ra
và nhuộm trong dung dịch ethidium bromide, soi gel ở bước sóng tử ngoại 300nm và chụp ảnh, đánh giá chất lượng DNA tổng số tách chiết được qua ảnh điện di.
2.2.6. Kỹ thuật AFLP đánh giá đa hình hệ gen
Kỹ thuật AFLP được thực hiện theo quy trình của hãng Applied BioSystems theo các bước sau:
(1) Cắt kiểm tra DNA với cặp enzyme EcoRI và MseI:
Trước khi thực hiện kỹ thuật AFLP với các mẫu DNA nghiên cứu, DNA được kiểm tra trước bằng các phản ứng cắt với các enzyme EcoRI và MseI như sau:
Thực hiện các phản ứng cắt riêng biệt 1 - 3 µg DNA với từng enzyme
EcoRI, MseI và với cả hai enzyme này. Thành phần phản ứng gồm:
DNA 1 - 3 µg EcoR I (20U/µL) 1 µL Mse I (10U/µL) 2 µL Buffer 2 5 µL H2O 42 µL Tổng thể tích phản ứng 50 µL Hỗn hợp phản ứng được ủ trong 2 giờ ở 37oC.
Điện di các sản phẩm phản ứng trên gel agarose 1,5% cùng với thang DNA chuẩn, nhuộm bản gel với ethidium bromide, quan sát trên máy soi UV để kiểm tra các sản phẩm cắt.
(2) Chuẩn bị mẫu và các thành phần cho các phản ứng khuếch đại AFLP
Biến tính các adaptor: Các MseI adapror và EcoRI adaptor được cung cấp
trong bộ Kit, làm nóng các ống chứa các adaptor trong bể ổn nhiệt ở 95oC trong 5 phút, sau đó để nguội ở nhiệt độ phòng, đảo đều bằng microcentrifuge ở tối đa 1400 vòng/10 giây.
T4 DNA ligase buffer 5X 0,4 µL
NaCl 0,5M 0,1 µL
BSA 1mg/mL 0,05 µL
MseI (100U) 0,1 µL
EcoRI (500U) 0,25 µL
T4 DNA ligase (100U) 1 µL
H2O 0,01 µL
Tổng thể tích 2 µL/1 phản ứng
Enzyme Master Mix được giữ lạnh cho đến khi sử dụng (chỉ chuẩn bị Enzyme Master Mix trong vòng 1 - 2 giờ trước khi dùng).
Phản ứng cắt DNA bằng enzyme và gắn adaptor Thành phần phản ứng:
T4 DNA ligase buffer 5X 3,6 µL
NaCl 0,5M 1 µL
BSA 1mg/mL 0,05 µL
Mse I adaptor 1 µL
EcoR I adaptor 1 µL Enzyme Master Mix 2 µL
H2O 5,9 µL
DNA (100ng/µL) 3 µL
Tổng thể tích 18 µL/1 phản ứng Phản ứng được thực hiện ở 37oC trong 2 giờ bằng máy PCR.
Để đảm bảo hiệu suất của phản ứng cắt, DNA cần có độ tinh sạch cao, nồng độ sử dụng khoảng 50ng. Các phân đoạn DNA được gắn với EcoRI adaptor và MseI adaptor, là những oligonucleotide sợi đôi gắn vào 2 đầu phân đoạn DNA.
(3) Phản ứng khuếch đại tiền chọn lọc
Tiến hành PCR tiền khuếch đại với các mồi chọn lọc, các mồi này được cấu tạo gồm 3 phần: trình tự lõi (CORE) + trình tự theo enzyme (ENZ) + trình tự chọn lọc (EXT). Chỉ những phân đoạn có trình tự bổ sung với trình tự chọn lọc mới được
nhân lên. Sự khuếch đại chọn lọc như vậy làm giảm số lượng phân đoạn hàng ngàn lần. Chỉ những đoạn DNA ngắn có một đầu là adaptor chứa trình tự bổ sung với trình tự của primer MseI và một đầu có adaptor chứa trình tự bổ sung với trình tự của primer EcoRI là được khuếch đại đáng kể, các đoạn có hai đầu là EcoRI bị mất đi do số lượng ít và hai đầu là MseI tự tạo thành vòng nhỏ DNA do cạnh tranh với primer. Sản phẩm tiền phản ứng được pha loãng và được dùng làm vật liệu để khuếch đại với đoạn mồi chọn lọc đánh dấu huỳnh quang.
- Thành phần phản ứng khuếch đại tiền chọn lọc:
AFLP preselective primer 1 µL
AFLP core mix 15 µL
DNA (sản phẩm của phản ứng gắn adaptor) 4 µL
Tổng thể tích 20 µL
- Phản ứng được thực hiện bằng máy PCR với chu trình nhiệt như sau:
Bảng 2.6. Chu trình nhiệt của phản ứng khuếch đại tiền chọn lọc
Hold 30 chu kỳ Hold Hold
72oC 2 min 94 °C 20 sec 56 °C 30 sec 72 °C 2 min 60 °C 30 min 4 °C (forever)
Điện di các sản phẩm của phản ứng khuếch đại tiền chọn lọc trên gel agarose 1,5% để kiểm tra chất lượng của các sản phẩm, bảo quản các sản phẩm của phản ứng khuếch đại tiền chọn lọc ở 2-6oC nếu chưa sử dụng ngay.
(4) Phản ứng khuếch đại chọn lọc
Sản phẩm PCR của bước tiền khuếch đại được pha loãng 10 lần bằng TE buffer và được dùng làm khuôn cho bước khuếch đại chọn lọc, sử dụng primer có gắn 3 nucleotide chọn lọc ở đầu 3’ và chỉ EcoRI primer được đánh dấu huỳnh
quang ở đầu 5’. Vì vậy, chỉ những sợi chứa EcoRI được phát hiện trên máy ABI
3100. PCR được tiến hành với thông số miêu tả bởi Cervera et al. (1996). Phản ứng bắt đầu với nhiệt độ cao gắn mồi tối hảo cho mồi chọn lọc. Nhiệt độ này giảm dần sẽ làm tăng sự kết hợp. Việc sử dụng primer gắn với 3 nucleotide chọn lọc sẽ giúp
hạn chế việc bắt cặp sai, chỉ nhân lên một số lượng lớn những băng chuyên biệt.
Bảng 2.7. Chu trình nhiệt của phản ứng khuếch đại chọn lọc
Duy trì Chu kỳ Số chu kỳ
94oC 94oC 66oC 72oC 1 2 phút 20 giây 30 giây 2 phút - 94 o C 65oC 72oC 1 20 giây 30 giây 2 phút - 94 o C 64oC 72oC 1 20 giây 30 giây 2 phút - 94 o C 63oC 72oC 1 20 giây 30 giây 2 phút - 94 o C 62oC 72oC 1 20 giây 30 giây 2 phút - 94 o C 61oC 72oC 1 20 giây 30 giây 2 phút - 94 o C 60oC 72oC 1 20 giây 30 giây 2 phút - 94 o C 59oC 72oC 1 20 giây 30 giây 2 phút - 94 o C 58oC 72oC 1 20 giây 30 giây 2 phút - 94 o C 57oC 72oC 1 20 giây 30 giây 2 phút - 94 o C 56oC 72oC 25 20 giây 30 giây 2 phút 60oC - 72 o C 1 30 giây 2 phút 4oC - 72 o C 1 ∞ 2 phút
Thành phần của phản ứng khuếch đại chọn lọc:
Sản phẩm của phản ứng khuếch đại tiền chọn lọc 3 µL
Mồi Mse-CTT (5 µM) 1 µL
Mồi gắn huỳnh quang EcoRI-ACG JOE (1 µM) 1 µL
AFLP core mix 15 µL
Tổng thể tích 20 µL
Phản ứng được thực hiện bằng máy PCR với chu trình nhiệt được trình bày ở Bảng 2.7, bảo quản các sản phẩm của phản ứng khuếch đại chọn lọc ở 2-6oC nếu chưa sử dụng ngay cho bước thí nghiệm tiếp theo.
2.2.7. Phân tích kết quả AFLP trên máy xác định trình tự tự động sử dụng điện di mao quản và phần mềm phân tích đoạn
Sản phẩm của phản ứng khuếch đại chọn lọc được xác định bằng máy phân tích trình tự sử dụng điện di mao quản ABI3100 (ABI3100 Genetic Analyzer) của hãng Applied Biosystems. Thành phần dung dịch đệm nạp mẫu như sau:
Deionized formamide 1,25 µL
Blue dextran / 25 mM EDTA loading solution 0,25 µL GeneScan-500 [ROX] size standard 0,5 µL Sau khi nạp mẫu và chọn chế độ phân tích, thiết bị vận hành hồn tồn tự động. Kết quả phân tích được xử lý trên máy tính bằng phần mềm GeneMapper® Software Version 4.1 AFLP® System Analysis (Invitrogen). Dữ liệu được xuất ra ở hai dạng: sơ đồ các peak (electropherogram) và bảng dữ liệu về sự xuất hiện/vắng mặt của các băng phân tích. Trong ma trận nhị phân, giá trị 1 xuất hiện có nghĩa là có băng sản phẩm PCR, giá trị 0 xuất hiện là khơng có băng. Các alen được đếm thông qua giá trị 1 hoặc 0. Dữ liệu được phân tích bằng việc sử dụng phối hợp các phần mềm PhyLip v3.6a3 Inference Package (Felsenstein et al., 1989), 100 giá trị
bootstrap được tạo ra sử dụng phần mềm SEQBOOT và 100 cây bootstrap được xây dựng. Cây phát sinh chủng loại được dựng bằng phần mềm MEGA (Kumar et al.,
2001). Kỹ thuật AFLP được thực hiện lặp lại ít nhất 2 lần đối với mỗi mẫu để kiểm chứng kết quả phân tích.
2.2.8. Kỹ thuật GBS phân tích hệ gen tơm sú
(1) Xây dựng thư viện GBS
Kỹ thuật GBS được thực hiện theo các bước sau (Elshire et al., 2011): Lựa chọn enzyme cắt hạn chế và thiết kế các adaptor
Enzyme cắt hạn chế (RE) được sử dụng là ApeKI. Đây là một endonuclease có khả năng nhận biết trình tự gồm 5 bp (GCWGC, trong đó W là A hoặc T) và cắt tạo ra một đầu so le 5’ gồm 3 bp.
Có 2 dạng adaptor khác nhau được sử dụng. Một barcode adaptor có cấu trúc đầu tận cùng gồm đoạn trình tự ngắn chứa từ 4 đến 8 bp ở đầu 3’ của sợi phía trên và một đoạn so le gồm 3 bp ở đầu 5’ của sợi phía dưới - bổ sung với đầu đính được tạo ra trên DNA khi cắt bởi enzyme ApeKI (CWG). Adaptor thứ hai là common
adaptor chỉ có một đầu đính phù hợp với enzyme ApeKI. Các adaptor được thiết kế sao cho vị trí nhận biết của enzyme ApeKI khơng xuất hiện ở trình tự adaptor bất kỳ và khơng bắt cặp bổ sung trở lại sau khi gắn với DNA hệ gen.
Chuẩn bị dung dịch các adaptor
Các oligonucleotide sợi đôi của mỗi barcode adaptor và common adaptor được pha loãng riêng biệt trong dung dịch TE (mỗi loại 50 µL) và được biến tính trong một thiết bị chu trình nhiệt (với chu trình nhiệt như sau: 95oC, 2 phút; giảm xuống 25oC với tốc độ giảm 0,1oC/giây; 25oC, 30 phút; giữ ở 4oC); Sau đó, các bardode adaptor và common adaptor được định lượng bằng phương pháp sử dụng chất nhuộm màu có đặc tính xen cài vào giữa sợi (PicoGreen®; Invitrogen); Pha lỗng
Hình 2.2. Trình tự các adaptor sử dụng trong xây dựng thư viện GBS
(Nguồn: Elshire et al., 2011)
Vị trí chèn DNA
Trình tự
barcode Đầu nhơ ApeKI
loại dung dịch adaptor với nhau theo tỷ lệ 1:1; Lấy 6 µL (∼ 0,06 pmol mỗi adaptor) hỗn hợp adaptor chia đều vào khay PCR 96 giếng và làm khô.
Cắt DNA tổng số bằng enzyme cắt hạn chế ApeKI và gắn với adaptor
Các mẫu DNA tổng số (đã được tách chiết và tinh sạch, pha loãng đến nồng độ 100ng/10µL) được đưa lên các giếng riêng biệt có chứa sẵn adaptor, làm khô giếng một lần nữa. Các mẫu (DNA tổng số trong các giếng chứa các adaptor) được cắt bằng enzyme ApeKI trong 2 giờ ở nhiệt độ 75oC, tổng thể tích dung dịch phản ứng là 20µL. Thành phần phản ứng như sau:
Các adaptor được gắn vào các đầu đính của các đoạn DNA (sau khi cắt) bằng cách bổ sung 30 µL dung dịch chứa 1,66x ligase buffer với ATP và T4 ligase (640 đơn vị đầu đính) vào mỗi giếng; ủ mẫu ở nhiệt độ 22oC trong 60 phút và làm nóng đến 65o
C trong 30 phút để bất hoạt enzyme T4 ligase. Các mẫu DNA sau khi cắt và gắn adaptor được tinh sạch bằng QIAquick PCR Purification Kit.
Phản ứng khuếch đại DNA
Các đoạn DNA tinh sạch từ các mẫu được trộn lại với nhau với tỷ lệ tương đương. Khoảng 100 ng sản phẩm DNA trộn từ các mẫu được sử dụng làm khuôn để tạo thư viện với cặp mồi primer1 và primer2 bắt cặp bổ sung với barcode adaptor và common adaptor: Primer1: (5’-3’)AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTA CACGACGCTCTTCCGATCT Primer2: (5’-3’)CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCC TGCTGAACCGCTCTTCCGATCT Genomic DNA (100ng / µL) 2 µL NEB Buffer 3 (10X) 2 µL ApeKI (4U/µL) 1 µL dH20 15 µL Tổng thể tích 20 µL
Thành phần phản ứng PCR:
DNA 10 µL
NEB 2x Taq Master Mix 25 µL
PCR Primer Mix (12.5 pmol/µL mỗi loại) 2 µL
dH2O 13 µL
Tổng thể tích 50 µL
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR như sau: 72oC trong 5 phút; 98oC trong 30 giây; sau đó là 18 chu kỳ: 98oC trong 30 giây, 65oC trong 30 giây, 72oC trong 30 giây, cuối cùng là bước kéo dài chuỗi ở 72oC trong 5 phút.
Tập hợp các đoạn DNA được tạo ra từ một genome sau khi cắt bởi enzyme cắt hạn chế, gắn với adaptor (trong đó có một adaptor chứa barcode) và được khuếch đại tạo thành một “thư viện”. Sản phẩm PCR có kích thước từ 300-500 bp được thu nhận bằng phương pháp cắt gel và tinh sạch bằng QIAquick PCR Purification Kit. Kích thước và độ sạch của thư viện DNA sau đó được đánh giá trên Bioanalyzer 2100 (Agilent Technology). Thư viện DNA được làm giàu và xác định trình tự cả
Hình 2.3. Các bước xây dựng thư viện GBS
(Nguồn: Elshire et al., 2011) 1. Chuẩn bị mẫu DNA và các adaptor 2. Cắt DNA bằng ApeKI 3. Gắn adaptor 4. Trộn các mẫu và tinh sạch 5. PCR 6. Tinh sạch sản phẩm PCR 7. Đánh giá kích thước các phân đoạn
hai chiều (pair-end) trên hệ thống Illumina NextSeq®500, theo hướng dẫn của nhà sản xuất, sử dụng NextSeq 500/550 High Output v2 Kit (300 chu kỳ).
(2) Xử lý dữ liệu GBS, thiết lập hệ gen tham chiếu tạm thời và xác định SNP
Dữ liệu GBS được xử lý và phân tích để phát hiện các SNP dựa theo phương pháp GBS-SNP-CROP (GBS SNP-Calling Reference Optional Pipeline) được mô tả bởi Melo et al. (2016). Dữ liệu thô được chuyển thành định dạng Fastq bằng công cụ BCL2FASTQ 2.1. Chất lượng trình tự được đánh giá bằng FastQC. Trình tự adaptor được loại bỏ bằng phần mềm Trimmomatic software v.0.3.6 (Bolger et al., 2014). Trình tự của từng mẫu được tách ra trên cơ sở nhận biết trình tự barcode sử dụng cơng cụ In-house script do nhóm nghiên cứu tự phát triển. Do hệ gen tơm sú chưa được cơng bố trình tự tham chiếu nên chúng tôi đã sử dụng các mẫu lắp ráp de
novo để tạo trình tự tham chiếu tạm thời theo phương pháp được mô tả bởi Melo et al. (2016), sử dụng các công cụ PEAR v.0.96 và USEARCH v.8.0.162 (Zhang et al., 2014; Edgar, 2010). Sau khi có trình tự tham chiếu, trình tự của các mẫu tơm sú
được so sánh với trình tự tham chiếu bằng BWA-MEM v.0.7 (Li et al., 2009a). Dữ liệu SNP được truy xuất bằng công cụ SAMtools v.1.2 (Li et al., 2009b). SNP được xác định khi gióng hàng các contig và sự sai khác nucleotide được phát hiện trên ít nhất bốn trình tự. Chỉ các SNP hai allen đáp ứng mức độ lặp lại như trên mới được xác định là SNP (Melo et al., 2016; Nguyễn Minh Thành et al., 2015; Kumar,
2014).
2.2.9. Chú giải các đoạn trình tự và xác định gen liên quan
Công cụ BlastX (E-value < 1e-6) được sử dụng để so sánh các contig với cơ sở dữ liệu NCBI non-redundant (Nr-NCBI) nhằm tìm kiếm sự tương đồng giữa các contig