Tên Contig Ký pháp HGVS của SNP tương ứng
Nucleotide thay thế
Nucleotide
tham chiếu Ghi chú
Contig83953 Contig83953:g.20T>C C T Trình tự bổ sung G A Trình tự mạch gốc Contig260347 Contig260347:g.19G>A A G Mạch gốc
Để xác định tương quan giữa các contig83953 và contig260347 chứa SNP với gen mã hóa protein MHC liên quan đến tăng trưởng ở tôm sú, chúng tôi đã tiến hành dịch mã các trình tự nucleotide của contig83953 và contig260347 thành các chuỗi amino acid tương ứng, sau đó so sánh với trình tự amino acid của gen mã hóa protein MHC. Kết quả dịch mã với 6 khung đọc (http://web.expasy.org) cho thấy:
này mã hóa chuỗi amino acid được dịch mã bắt đầu từ vị trí nucleotide thứ 2 theo chiều 5’3’ của mạch bổ sung với trình tự của contig83953; (2) Chuỗi amino acid được mã hóa bởi contig260347 thuộc khung đọc 5’3’
Frame 3 (+3). Khung đọc này mã hóa chuỗi amino acid được dịch mã bắt đầu từ vị trí nucleotide thứ 3 theo chiều 5’3’ của mạch gốc.
Kết quả dịch mã được trình bày ở Bảng 3.13.
Bảng 3.13. Trình tự amino acid tương ứng của contig83953 và contig260347
Tên contig Trình tự amino acid tương ứng (http://web.expasy.org) Tổng số amino acid của chuỗi Contig83953 AERAQTLANSAEKKQKNFDKIISEWKLKIDDL 32 Contig260347 RLEEAEMetQIESLNVKNLHLEKTKMetRA 30
Để kiểm tra sự chính xác của các trình tự amino acid, chúng tơi đã tiến hành Blast (Basic Local Alignment Search Tool) bằng công cụ Uniprot (http://www.uniprot.org) với cả hai loại dữ liệu đầu vào là trình tự amino acid và trình tự nucleotide của contig83953 và contig260347. Kết quả thu được từ hai loại dữ liệu đầu vào hoàn toàn trùng khớp nhau về tỷ lệ tương đồng giữa chuỗi amino acid của contig83953 và contig260347 so với protein MHC ở các loài khác nhau (Bảng 3.14 và Bảng 3.15).
Kết quả ở Bảng 3.14 cho thấy: trình tự amino acid tương ứng của contig83953 đạt tỷ lệ tương đồng cao nhất (90,6%) với trình tự amino acid của protein MHCa ở lồi tơm Penaeus japonicus, tỷ lệ tương đồng với MHC1 ở hai loài tôm khác là Penaeus monodon và Litopenaeus vannamei cũng tương đối cao (đều
đạt 87,5%). Trong khi đó, kết quả ở Bảng 3.15 cho thấy: trình tự amino acid tương ứng của contig260347 đạt tỷ lệ tương đồng cao nhất (96,2%) với trình tự amino acid của protein MHC ở cả ba lồi tơm Penaeus monodon, Penaeus japonicus và
Bảng 3.14. Các tỷ lệ tương đồng cao nhất (top 5) giữa contig83953 với protein MHC STT GenBank ID Protein MHC (loài tương ứng) Tỷ lệ tương đồng (%) Vị trí amino acid trên protein MHC 1 F8WR03 Myosin heavy chain type a
(Penaeus japonicus)
90,6% 1431-1462
2 K4Q111 Myosin heavy chain type 1 (Litopenaeus vannamei)
87,5% 1431-1462
3 K4Q4N8 Myosin heavy chain type 1 (Penaeus monodon)
87,5% 1432-1463
4 Q6XGZ8 Slow muscle myosin S1 heavy chain (Homarus americanus)
83,9% 30-60
5 B0W188 Myosin heavy chain (Culex quinquefasciatus)
80,6% 1399-1429
Bảng 3.15. Các tỷ lệ tương đồng cao nhất (top 5) giữa contig260347 với protein MHC STT GeneBank ID Protein MHC (loài tương ứng) Tỷ lệ tương đồng (%) Vị trí amino acid trên protein MHC 1 K4Q4N8 Myosin heavy chain type 1
(Penaeus monodon)
96,2 1396-1425
2 F8WR03 Myosin heavy chain type a (Penaeus japonicus)
96,2 1395-1420
3 K4Q111 Myosin heavy chain type 1 (Litopenaeus vannamei)
96,2 1395-1420
4 K4Q2Y1 Myosin heavy chain type 2 (Penaeus monodon)
76,0 1396-1418
5 K4Q2S1 Myosin heavy chain type 2 (Litopenaeus vannamei)
Như vậy, với việc sử dụng hệ gen tham chiếu tạm thời của tôm sú P. monodon được thiết lập de novo để sàng lọc SNP, nghiên cứu của chúng tôi đã xác
định được hai SNP ở nhóm tơm sú tăng trưởng nhanh.
3.3.5. Xác định vùng tương đồng giữa contig chứa SNP so với gen mã hóa protein MHC, xác định codon chứa SNP và vị trí tương ứng của chỉ thị SNP trên gen MHC
Bằng cách so sánh các chuỗi trình tự (nucleotide, amino acid) của contig83953 và contig260347 với trình tự của gen MHCa và MHC1 để xác định vùng tương đồng giữa chúng, chúng tơi đã xác định được vị trí phân vùng chức năng trên gen MHCa và MHC1 phù hợp với trình tự các contig83953 và contig260347 chứa SNP, đồng thời xác định chính xác codon chứa SNP cũng như sự biến đổi của amino acid có thể xảy ra do sự xuất hiện SNP (Hình 3.8, Hình 3.9, Hình 3.10, Hình 3.11).
Kết quả ở Hình 3.8 và Hình 3.9 cho thấy: vùng tương đồng về amino acid của contig83953 ở tôm sú P. Monodon trong nghiên cứu này so với protein MHCa ở tôm he Nhật bản P. Japonicus nằm trong khoảng vị trí amino acid 1431 - 1462; vị trí nucleotide tương đồng từ 4408 - 4505. Vùng tương đồng này thuộc phân vùng chức năng LMM (light meromyosin) trên phân tử protein myosin.
Kết quả ở Hình 3.10 và Hình 3.11 cho thấy: vùng tương đồng về amino acid của contig260347 ở tôm sú P. monodon trong nghiên cứu này so với protein MHC1 ở tôm sú trên genBank nằm trong khoảng vị trí amino acid 1396 - 1422; vị trí nucleotide tương đồng từ 4302 - 4379. Vùng tương đồng này cũng thuộc phân vùng chức năng LMM trên phân tử protein myosin.
Hình 3.9. Vùng tương đồng trình tự amino acid giữa contig83953 của tôm sú P. monodon với protein MHCa ở tôm he Nhật Bản P. japonicus
(vị trí amino acid 1431 - 1462) LMM S2 Contig 83953 Contig 83953 Contig 83953
Hình 3.8. Vùng tương đồng nucleotide giữa mạch bổ sung của contig83953 của tơm sú P. monodon so với trình tự gen MHCa ở tôm he
Nhật Bản P. japonicus (vị trí nucleotide 4408 - 4505).
Contig 83953
Contig 83953
Hình 3.10. Vùng tương đồng nucleotide giữa contig260347 so với trình tự gen MHC1 ở tơm sú P. monodon (vị trí nucleotide 4302 - 4379)
Contig260347
Contig260347
Hình 3.11. Vùng tương đồng trình tự amino acid giữa contig260347 với protein MHC1 ở tơm sú P. monodon (vị trí amino acid 1396 - 1422)
LMM S2
Contig260347
Các kết quả chỉ ra trên Hình 3.8, Hình 3.9, Hình 3.10, Hình 3.11 cho thấy rõ các codon chứa các SNP. Cụ thể như sau:
SNP T C tại vị trí nucleotide thứ 20 trên mạch bổ sung với contig83953 [Contig83953:g.20T>C], tức là SNP A G trên mạch gốc contig83953 được xác định là vị trí SNP A4486G trên gen MHCa (Hình 3.8). SNP này là nucleotide thứ 3 trong bộ ba (codon) mã hóa amino acid, làm biến đổi codon
AAA thành AAG. Cả hai codon này đều mã hóa amino acid Lysine (K) với
vị trí amino acid tương ứng trên protein MHCa là K1456K (Hình 3.9). Nói cách khác, SNP này khơng làm thay đổi amino acid tương ứng.
SNP G A tại vị trí nucleotide thứ 19 trên contig260347 [Contig260347:g.19G>A] được xác định là vị trí SNP G4320A trên gen
MHC1 (Hình 3.10). SNP này là nucleotide thứ 2 trong bộ ba mã hóa amino acid, làm biến đổi codon GGA (mã hóa amino acid Glycine - G) thành GAA (mã hóa amino acid Glutamic - E). Vị trí amino acid tương ứng trên protein MHC1 là G1401E (Hình 3.11).
3.4. SÀNG LỌC CHỈ THỊ SNP G>A Ở TÔM SÚ TĂNG TRƯỞNG NHANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP KASP
Kết quả kiểm tra trên 40 mẫu tôm sú cái tăng trưởng nhanh thế hệ G1 (Hình 3.12) cho thấy: hầu hết các mẫu tơm sú tăng trưởng nhanh (28/40 mẫu) chứa SNP dạng đồng hợp tử A:A (màu xanh dương); chỉ có 2/40 mẫu chứa SNP dạng đồng hợp tử G:G (màu đỏ); còn lại là 10/40 mẫu chứa SNP dạng dị hợp tử G:A (màu xanh lá cây).
Kết quả này cho thấy: việc sử dụng các mồi xuôi và mồi ngược được thiết kế đặc hiệu với trình tự DNA chứa SNP G>A, trong đó trình tự mồi xi đặc hiệu với alen kiểu dại được gắn HEX-tail (màu đỏ) và trình tự mồi xi đặc hiệu với alen đột biến được gắn FAM-tail (màu xanh dương) đã phát hiện thấy đột biến G4320A thuộc gen MHC1 có mặt ở 38 trong số 40 mẫu tơm sú được kiểm tra (chiếm 95%). Trong số 38 cá thể tôm sú mang đột biến G4320A, có 28 cá thể mang kiểu gen đồng hợp tử (tương ứng với 28 tín hiệu huỳnh quang màu xanh dương) và có 10 cá
thể mang kiểu gen dị hợp tử (tương ứng với 10 tín hiệu huỳnh quang màu xanh lá cây) ở Hình 3.12.
Hình 3.12. Kết quả phân tích tín hiệu huỳnh quang trong kỹ thuật KASP sàng lọc chỉ thị SNP G>A thuộc gen MHC1 ở tôm sú tăng trưởng nhanh
- Các chấm màu xanh dương thể hiện các mẫu tơm sú tăng trưởng nhanh có đồng hợp tử A:A (28/40 mẫu);
- Các chấm màu đỏ thể hiện các mẫu tơm tăng trưởng nhanh có đồng hợp tử G:G 2/40 mẫu;
- Các chấm màu xanh lá cây thể hiện các mẫu tôm tăng trưởng nhanh có dị hợp tử G:A 10/40 mẫu;
- Các chấm màu đen là tín hiệu huỳnh quang bị nhiễu;
- Các mẫu đối chứng khơng có tín hiệu huỳnh quang (khơng xuất hiện trên hình).
Chương 4
BÀN LUẬN KẾT QUẢ
4.1. CHỌN ĐỊA ĐIỂM THU MẪU ĐỂ NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH DI TRUYỀN
Việc chọn địa điểm thu mẫu tôm sú tự nhiên để thu được các mẫu tôm thuộc các quần đàn vùng biển Bắc Trung Bộ, Nam Trung Bộ và Nam Bộ dựa trên các yếu tố cơ bản thường được các chuyên gia trong ngành thủy sản sử dụng để làm căn cứ phân chia các quần đàn. Các căn cứ phân chia quần đàn thu mẫu tôm sú bao gồm: vị trí địa lý, điều kiện tự nhiên, đặc điểm phân bố của lồi, đặc điểm dịng hải lưu mà tơm có khả năng di cư và đặc điểm nuôi trồng thủy sản ở các địa phương. Trong số đó, yếu tố đáng lưu ý là đặc điểm nuôi trồng thủy sản để đảm bảo khả năng thu được các mẫu tơm tự nhiên mang tính đại diện nhất. Trong các nghiên cứu đánh giá đa hình di truyền các quần đàn tôm sú tự nhiên của Việt Nam cũng cho thấy địa điểm được chọn để thu mẫu của các tác giả khác nhau có sự tương đồng. Nguyễn Thị Thảo et al. (2004) thu mẫu tại vùng Trung Bộ và Nam Bộ. Nguyễn Giang Thu (2015) thu mẫu tại vùng Bắc Trung Bộ (Nghệ An - Hà Tĩnh). Nguyễn Hải Bằng (2017) thu mẫu tại vùng Bắc Trung Bộ (Nghệ An).
Trong nghiên cứu này, mẫu được thu ở vùng biển các tỉnh Nghệ An (Bắc Trung Bộ), Khánh Hòa (Nam Trung Bộ) và Bạc Liêu (Nam Bộ) và thu xa bờ là do: (1) tại vùng biển ở các địa phương này hiện vẫn còn thu được các mẫu tôm sú bố mẹ từ tự nhiên và (2) những hoạt động nuôi tôm sú thương phẩm trong các ao nuôi không bị pha tạp bởi nguồn tơm sú ở nơi khác có thể thất thốt ra tự nhiên làm ảnh hưởng đến quần đàn tôm sú tự nhiên ở các địa phương này. Các mẫu tôm của mỗi quần đàn được thu không tập trung tại một tọa độ cố định mà được thu tại các vị trí khác nhau trong vùng biển của từng quần đàn, đồng thời thu nhiều lần tại nhiều thời điểm khác nhau. Do đó, các mẫu được chọn mang tính đại diện.
Cơ sở khoa học của việc chọn địa điểm thu mẫu tôm sú xa bờ và thu nhiều lần tại nhiều thời điểm khác nhau đã được chỉ ra trong các nghiên cứu về tôm. Trong mơi trường biển, nhón tơm Penaeid thường di cư theo các tầng nước đặc trưng riêng
của mỗi loài (Perez-Farfante, 1969). Các cá thể giáp xác trưởng thành thường di cư từ vùng ven bờ ra môi trường biển rồi thành thục, bắt cặp và sinh sản tập trung ở những vùng nước sâu riêng biệt (Chamberlain, 1985). Đặc biệt, tôm sú trưởng thành di cư thành thục tập trung ở độ sâu khoảng 160 m (Motoh, 1984).
Trong các nghiên cứu về quần thể các đối tượng thủy sản nói chung và tơm nói riêng, phương pháp điều tra chọn mẫu đã được đánh giá là phù hợp với thực tiễn. Với nguyên tắc thu mẫu đại diện như đã mô tả trong nghiên cứu này, kết quả phân tích trên mẫu đại diện cho phép suy rộng cho tổng thể. Phương pháp này có ưu điểm là tiết kiệm thời gian và chi phí thực hiện nhưng vẫn đảm bảo độ tin cậy cho kết quả nghiên cứu. Ngoài ra, do thực hiện nghiên cứu trên các mẫu được lựa chọn nên kết quả thu được sẽ là cơ sở cho việc mở rộng phạm vi nghiên cứu cả về nội dung lẫn cỡ mẫu (Dương Long Trì, 2007). Hạn chế của phương pháp điều tra chọn mẫu là ln có sai số chọn mẫu. Tuy nhiên, sai số này có thể được hạn chế bằng cách tăng cường các yếu tố đảm bảo tính đại diện cao của mẫu. Ngoài ra, các nghiên cứu sâu hơn về di truyền số lượng và các nghiên cứu bổ trợ khác nếu được thực hiện cũng sẽ góp phần đánh giá chính xác các quần đàn nghiên cứu.
4.2. TÁCH DNA TỔNG SỐ TỪ TÔM SÚ TẠO VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Để đánh giá đa hình của các quần đàn tôm sú bằng kỹ thuật AFLP và thực hiện kỹ thuật GBS đòi hỏi một lượng DNA khá lớn với độ tinh sạch cao. Chất lượng của DNA tách chiết được từ các mẫu nghiên cứu là một trong những yếu tố quan trọng nhất quyết định thành cơng của các thí nghiệm phân tích AFLP và GBS. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thử nghiệm 2 phương pháp tách chiết DNA tổng số theo phương pháp thủ công và sử dụng bộ Kit tinh sạch PureLink Genomic DNA (Life Technologies). Kết quả cho thấy phương pháp thủ công thu được hàm lượng DNA cao nhưng độ tinh sạch thấp (A260/A280 < 1,8) không đáp ứng yêu cầu kỹ thuật, trong khi đó sử dụng bộ Kit thương mại thu được DNA có độ tinh sạch cao (A260/A280 > 1,8) nhưng lượng DNA thu được khơng đủ cho phân tích. Do đó, chúng tơi đã tiến hành tinh sạch DNA theo 2 bước, đầu tiên DNA được tinh sạch bằng phương pháp thủ cơng như mơ tả ở trên, sau đó được tinh sạch tiếp một lần
nữa bằng Kit tinh sạch PureLink Genomic DNA (Life Technologies). Do đó, các mẫu DNA được chọn để phân tích dù chiếm tỷ lệ không lớn trong tổng số mẫu thu được nhưng DNA có độ sạch cao và nồng độ DNA đảm bảo cho việc thực hiện các nghiên cứu.
Trong số các quy trình tách chiết DNA phổ biến hiện nay, quy trình hóa học (sử dụng các dung mơi hữu cơ như phenol, chloroform) để tách chiết tuy phải thực hiện qua nhiều bước nhưng thu được mẫu DNA sợi đơi có chất lượng tốt (Hoff- Olsen et al., 1999). Các phương pháp khác như phương pháp sử dụng Chelex hoặc silica vô cơ rất đơn giản và tiết kiệm chi phí do chỉ cần thực hiện trong một ống tách chiết, trong đó ion Mg2+ liên kết với hạt nhựa và thu được sản phẩm là DNA sợi đơn. Các phương pháp tách chiết pha rắn, ví dụ phương pháp DNA IQ của Promega (Eminovic et al., 2005), PrepFiler của Applied Biosystems (Brevnov et al., 2009)
hay QIAamp kit của Qiagen (Castella et al., 2006; Greenspoon et al., 1998) đều có quy trình thực hiện đơn giản, trong đó DNA liên kết với hạt từ hoặc silica. Ngồi ra cịn có phương pháp sử dụng giấy lọc FTA được phát triển từ những năm 1980 (Thacker et al., 2000). Mỗi phương pháp đều có ưu nhược điểm riêng và được ứng dụng tùy theo mục đích nghiên cứu.
Đối với nghiên cứu đánh giá đa hình AFLP của các quần đàn tơm sú tự nhiên, việc kết hợp giữa phương pháp hóa học với tách bằng kit trong nghiên cứu của chúng tôi đã cho thấy hiệu quả tách chiết tăng đáng kể nhằm thu được các mẫu DNA đảm bảo yêu cầu về nồng độ và độ sạch.
Về mặt lý thuyết, nếu nghiên cứu tiến hành trên cỡ mẫu càng lớn thì kết quả thu được càng chính xác. Tuy nhiên, với phương pháp thu mẫu đảm bảo tính đại diện nên mặc dù chỉ chọn 60 trong số 150 mẫu DNA tổng số (chiếm 40%), mỗi quần đàn chọn 20 mẫu DNA để phân tích vẫn đảm bảo được tính đại diện và tính khách quan, chính xác của kết quả nghiên cứu. Việc chọn số lượng mẫu của mỗi quần đàn để đánh giá đa hình AFLP dựa trên chất lượng mẫu tôm sú thu được và chất lượng DNA tổng số tách chiết từ các mẫu mô cơ tôm sú. Rumisha et al. (2017) nghiên cứu đa dạng di truyền của tôm sú liên quan đến ô nhiễm kim loại đã sử dụng
159 cá thể thu từ tám địa điểm khác nhau ở bờ biển Tanzania (trung bình mỗi địa điểm khoảng 20 mẫu), sử dụng 7 microsatellite đã cho thấy mức độ đa hình cao (4 - 44 alen). Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thảo et al .(2004) đánh giá đa hình di truyền 3 quần đàn tôm sú bằng phương pháp microsatellite đã sử dụng từ 21, 30 và 32 mẫu đối với ba quần đàn, trong đó có hai quần đàn thu từ vùng Nam Bộ và Trung Bộ. Trên các đối tượng khác, chẳng hạn nghiên cứu đa hình di truyền của 13 quần thể loài Aegiceras corniculatum (một loại cây sống ở vùng ngập mặn) bằng phương
pháp AFLP, Deng et al. (2009) đã thu thập 202 mẫu đại diện, tương ứng mỗi quần thể có từ 12 - 16 mẫu được chọn ngẫu nhiên cho nghiên cứu.
4.3. KẾT QUẢ PHẢN ỨNG TIỀN CHỌN LỌC AFLP
Kỹ thuật AFLP trải qua nhiều bước thực hiện. Mức độ thành công của những