Tác dụng và cơ chế tác dụng cải thiện trí nhớ của các hoạt chất tiềm

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Tác dụng và cơ chế tác dụng cải thiện trí nhớ của hương nhu tía

3.1.3. Tác dụng và cơ chế tác dụng cải thiện trí nhớ của các hoạt chất tiềm

Kết quả nghiên cứu trên đã chứng minh thành phần hĩa học đĩng vai trò quan trọng với tác dụng cải thiện trí nhớ của OS cĩ thể nằm trong phân đoạn ethyl acetat của cao chiết này. Kết quả phân lập các thành phần chính trong cao OS-E thu được 5 chất bao gồm: acid ursolic, acid oleanolic, luteolin, apigenin và luteolin-7-O-β-D- glucuronid. Đồng thời, kết quả phân tích HPLC cho thấy OS-E cĩ hàm lượng acid ursolic và acid oleanolic rất cao, lần lượt là 11% và 10,27% (Phụ lục 2). Điều này định hướng cho nghiên cứu tiếp tục với tác dụng cải thiện trí nhớ tiềm năng của acid ursolic và acid oleanolic.

3.1.3.1. Tác dụng cải thiện trí nhớ khơng gian ngắn hạn của acid ursolic và acid oleanolic trên thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến

Ảnh hưởng của acid ursolic (UA) và acid oleanolic (OA) lên trí nhớ khơng gian ngắn hạn của chuột OBX được đánh giá thơng qua thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến. Kết quả được thể hiện ở Hình 3.11., như sau:

- Chuột OBX cĩ tỷ lệ thời gian khám phá cánh mới chỉ xấp xỉ 33%, thấp hơn đáng kể so với lơ sinh lý (p < 0,05).

- Điều trị bằng DNP 1,5 mg/kg/ngày làm tăng đáng kể tỷ lệ thời gian khám phá cánh mới so với lơ chuột OBX khơng được điều trị (p < 0,05), tương đồng với kết quả giai đoạn nghiên cứu trước đĩ (mục 3.1.1.2).

- Lơ chuột OBX được điều trị bằng UA liều 6 và 12 mg/kg/ngày đều cho thấy tỷ lệ thời gian khám phá cánh mới cao hơn rõ rệt so với lơ bệnh lý (tương ứng p = 0,022; p = 0,019 < 0,05) (Hình 3.11A).

- Chuột OBX được điều trị bằng OA ở mức liều thấp (cả 6 và 12 mg/kg) cĩ tỷ lệ thời gian khám phá cánh mới khơng cĩ sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lơ bệnh lý (tương ứng p = 0,131; p = 0,235 > 0,05). Trong khi đĩ, OA liều 24 mg/kg/ngày đã cải thiện đáng kể trí nhớ khơng gian ngắn hạn của chuột OBX, thể hiện bằng sự tăng lên đáng kể thời gian khám phá cánh mới so với chuột bệnh lý (p = 0,016 < 0,05) (Hình 3.11B).

Hình 3.11. Ảnh hưởng của UA và OA đến trí nhớ khơng gian ngắn hạn của chuột

OBX trong mê lộ chữ Y cải tiến.

Đồ thị biểu diễn: (A) Tác dụng của UA (6, 12 mg/kg, p.o.); (B) Tác dụng của OA (6, 12, 24 mg/kg, p.o.) đến tỷ lệ phần trăm thời gian khám phá cánh mới của chuột OBX trong giai đoạn kiểm tra (*p <

0,05 khi so sánh lơ sinh lý với lơ bệnh lý,

#p < 0,05 khi so sánh các lơ thuốc với lơ bệnh lý OBX, n = 9-11). (one-way ANOVA, hậu kiểm Student-Newman-Keul’s).

Như vậy, UA dùng đường uống với cả 2 mức liều 6 và 12 mg/kg/ngày và DNP 1,5 mg/kg/ngày, tiêm phúc mạc đều cĩ tác dụng cải thiện trí nhớ làm việc liên quan đến khơng gian của chuột OBX. Trong khi OA chỉ cĩ tác dụng cải thiện trí nhớ khơng gian ngắn hạn rõ rệt trên chuột OBX ở mức liều 24 mg/kg/ngày, mà chưa thể hiện tác dụng này ở mức liều thấp (6 và 12 mg/kg).

3.1.3.2. Tác dụng cải thiện trí nhớ khơng gian dài hạn của acid ursolic và acid oleanolic trong thử nghiệm mê lộ nước Morris (MWM)

Mê lộ nước Morris được dùng để đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ khơng gian dài hạn (được hình thành qua quá trình học tập và ghi nhớ) của UA ở 2 mức liều 6 và 12 mg/kg. Do OA ở liều 6 mg/kg khơng thể hiện tác dụng cải thiện trí nhớ ngắn hạn đáng kể trong mê lộ chữ Y cải tiến nên ở thử nghiệm này chỉ 2 mức liều OA là 12 và 24 mg/kg được tiếp tục đánh giá tác dụng.

+ Giai đoạn luyện tập

và Hình 3.14. (tốc độ bơi) như sau:

- Chuột thử nghiệm được tham gia bài tập nhìn thấy bến đỗ (Ngày 1) để làm quen với mê lộ. Tiềm thời (thời gian tìm thấy bến đỗ) trung bình của các lơ chuột và quãng đường bơi trung bình của các lơ chuột khơng cĩ sự khác biệt trong bài tập này (p > 0,05).

- Trong bài tập khơng nhìn thấy bến đỗ (từ ngày 2 đến ngày 5), phân tích bằng phương pháp so sánh phương sai hai nhân tố (two-way ANOVA), hậu kiểm (post hoc) bằng Student-Newman-Keul’s cho thấy thơng số tiềm thời và quãng đường bơi trung bình của lơ chuột sinh lý và các lơ chuột OBX được điều trị cĩ xu hướng giảm dần qua các ngày luyện tập, trong khi lơ bệnh lý khơng cĩ xu hướng này. Lơ sinh lý cĩ tiềm thời và quãng đường bơi rút ngắn đáng kể so với lơ bệnh lý OBX trong cả 2 thử nghiệm tác dụng của UA và OA, thể hiện khả năng học nhớ khơng gian đã mất đi khi chuột bị loại bỏ thùy khứu giác (lần lượt là p < 0,001; p = 0,002 < 0,01 (UA) và p

<0,001; p = 0,03 < 0,05 (OA)).

- Chuột OBX được điều trị bằng DNP 1,5 mg/kg/ngày đã giảm đáng kể cả 2 thơng số tiềm thời và quãng đường bơi so với lơ bệnh lý (tương ứng p = 0,008 < 0,01;

p < 0,001 (UA) và p = 0,016; p = 0,042 (OA) < 0,05), chứng tỏ DNP đã cải thiện khả

năng học và ghi nhớ khơng gian của chuột OBX.

- Điều trị chuột OBX bằng UA ở 2 mức liều 6 và 12 mg/kg đều làm giảm rõ rệt thơng số tiềm thời và quãng đường bơi so với lơ chuột OBX khơng được điều trị (tương ứng p = 0,013; p = 0,014 < 0,05 và p = 0,001; p = 0,002 < 0,01), chỉ ra tác dụng cải thiện rõ ràng của acid ursolic đối với sự thiếu hụt trí nhớ khơng gian dài hạn ở chuột OBX.

- Điều trị chuột OBX bằng OA mức liều 24 mg/kg/ngày cũng làm giảm rõ rệt tiềm thời và quãng đường bơi trung bình để chuột tìm thấy bến đỗ so với lơ bệnh lý (tương ứng p = 0,048 < 0,05; p = 0,005 < 0,01), chứng tỏ OA ở liều 24 mg/kg/ngày đã cải thiện sự thiếu hụt khả năng học nhớ khơng gian của chuột bị loại bỏ thùy khứu giác. Trong khi đĩ, OA mức liều thấp hơn (12 mg/kg/ngày) chưa cho thấy rõ tác dụng cải thiện khả năng học nhớ khơng gian khi khơng cĩ sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê về thơng số tiềm thời và quãng đường bơi trung bình so với lơ bệnh lý khơng được điều trị (tương ứng p = 0,085; p = 0,058 > 0,05).

Hình 3.12. Ảnh hưởng của UA và OA lên thơng số tiềm thời của chuột OBX giai đoạn

luyện tập trong thử nghiệm mê lộ nước Morris (MWM)

Đồ thị đường biểu diễn: (A) Acid ursolic; (B) Acid oleanolic (***p < 0,001, *p < 0,05 khi so sánh lơ sinh lý với lơ bệnh lý, #p < 0,05, ##p < 0,01 khi so sánh các lơ thuốc với lơ bệnh lý OBX, n = 9-11).

(two-way ANOVA, hậu kiểm Student-Newman-Keul’s).

Hình 3.13. Ảnh hưởng của UA và OA lên thơng số quãng đường bơi của chuột OBX

giai đoạn luyện tập trong MWM

Đồ thị đường biểu diễn: (A) Acid ursolic; (B) Acid oleanolic (*p < 0,05, **p < 0,01 khi so sánh lơ sinh lý với lơ bệnh lý, #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 khi so sánh các lơ thuốc với lơ bệnh lý

OBX, n = 9-11).

- Tốc độ bơi khơng cĩ sự khác nhau giữa các lơ chuột trong các ngày luyện tập (p > 0,05), cho thấy chuột OBX và chuột OBX được điều trị bằng thuốc khơng bị ảnh hưởng đến vận động tự nhiên. Kết quả này cũng giúp loại bỏ giả thuyết thời gian tìm thấy bến đỗ khác biệt giữa các lơ chuột là do khác biệt trong tốc độ bơi.

Hình 3.14. Ảnh hưởng của UA và OA lên thơng số tốc độ bơi của chuột OBX giai

đoạn luyện tập trong MWM

Đồ thị đường biểu diễn: (A) Acid ursolic; (B) Acid oleanolic (n = 9-11). (two-way ANOVA, hậu kiểm Student-Newman-Keul’s).

+ Giai đoạn probe test

Thử nghiệm probe test đã được tiến hành vào ngày thứ 6 để kiểm tra xem động vật cĩ thực sự sử dụng các bảng chỉ dẫn khơng gian để tìm kiếm bến đỗ hay khơng. Chuột phải nhớ lại vị trí của bến đỗ dựa vào các bảng chỉ dẫn này, và cĩ xu hướng bơi lâu hơn tại cung phần tư đích (nơi đã từng đặt bến đỗ trong những ngày luyện tập trước đĩ). Kết quả giai đoạn thử nghiệm (probe test) được trình bày ở Hình 3.15.

- Chuột OBX khơng được điều trị chỉ cĩ xấp xỉ 1/4 thời gian chuột được tự do bơi trong MWM, tương đương với mức cơ hội, dành để bơi ở cung phần tư đích, thấp hơn đáng kể so với lơ sinh lý (tương ứng p = 0,004 < 0,01 (UA) và p = 0,02 <

0,05(OA)), cho thấy sự thiếu hụt khả năng học nhớ khơng gian ở chuột bị loại bỏ thùy khứu giác.

- Tiêm DNP 1,5 mg/kg hàng ngày đã làm tăng rõ rệt thời gian chuột bơi ở cung phần tư đích so với lơ bệnh lý (tương ứng p = 0,01 (UA) và p = 0,02 (OA) < 0,05).

đều cĩ thời gian bơi ở cung phần tư đích cao hơn đáng kể so với chuột OBX khơng được điều trị (tương ứng p = 0,042; p = 0,013 < 0,05), chứng tỏ rằng acid ursolic cĩ tác dụng cải thiện tình trạng suy giảm trí nhớ khơng gian dài hạn của chuột OBX.

- Điều trị với OA 24 mg/kg/ngày đường uống cũng làm tăng đáng kể thời gian chuột bơi ở cung phần tư đích so với lơ OBX khơng được điều trị (p = 0,02 < 0,05).

- Phù hợp với kết quả ở giai đoạn luyện tập trước đĩ, mức liều OA 12 mg/kg/ngày khơng thể hiện tác dụng rõ rệt khi thời gian chuột bơi ở cung phần tư đích chỉ cao hơn một chút so với lơ bệnh lý, khác biệt khơng đạt ý nghĩa thống kê (p = 0,13 > 0,05).

Như vậy, acid ursolic dùng đường uống hàng ngày với mức liều 6 và 12 mg/kg cho tác dụng cải thiện rõ rệt trí nhớ khơng gian dài hạn của chuột OBX, tương tự với thuốc chứng dương DNP với liều 1,5 mg/kg/ngày. Trong khi đĩ, tác dụng cải thiện sự thiếu hụt trí nhớ khơng gian dài hạn của OA trên chuột OBX là tác dụng phụ thuộc liều, và chỉ ở liều 24 mg/kg/ngày thì OA mới thể hiện đáng kể tác dụng này.

Hình 3.15. Ảnh hưởng của UA và OA đến thơng số thời gian bơi ở cung phần tư đích

của chuột OBX giai đoạn probe test trong MWM.

Đồ thị biểu diễn: (A) Acid ursolic; (B) Acid oleanolic (**p < 0,01, *p < 0,05 khi so sánh lơ sinh lý với lơ bệnh lý, ##p < 0,01, #p < 0,05 khi so sánh các lơ thuốc với lơ bệnh lý OBX, n = 9-11).

(one-way ANOVA, hậu kiểm Student-Newman-Keul’s).

3.1.3.3. Ảnh hưởng của acid ursolic lên hoạt độ enzym AChE ở vỏ não ex vivo

Do acid ursolic cho thấy tác dụng cải thiện trí nhớ tiềm năng hơn acid oleanolic (acid ursolic tác dụng rõ rệt ở liều thấp 6 mg/kg, trong khi acid oleanolic chỉ thể hiện tác dụng ở liều cao 24 mg/kg) nên nghiên cứu chỉ tiếp tục tìm hiểu cơ chế tác dụng của acid ursolic.

Acetylcholin tồn tại càng lâu trong não thì các tế bào não gợi nhắc trí nhớ càng lâu. Vì thế các chất ức chế enzym acetylcholinesterase (AChE, enzym xúc tác cho phản ứng phân hủy acetycholine thành cholin và acid acetic) cĩ thể giúp cải thiện sự suy giảm trí nhớ của bệnh nhân Alzheimer [168]. Để tìm hiểu cơ chế tác dụng của acid ursolic cĩ thơng qua ức chế AChE, tương tự như donepezil hay khơng, hoạt độ enzym AChE trong vỏ não chuột được đánh giá trên ex vivo.

Hình 3.16. Ảnh hưởng của UA đến hoạt độ enzym AChE trong vỏ não chuột OBX

(#p < 0,05 khi so sánh các lơ thuốc với lơ bệnh lý OBX, n = 8-10). (one-way ANOVA, hậu kiểm Student-Newman-Keul’s).

Kết quả được thể hiện dưới dạng biểu đồ cột ở Hình 3.16. như sau:

- Hoạt độ enzym AChE vỏ não của chuột OBX được điều trị bằng DNP 1,5 mg/kg/ngày thấp hơn đáng kể so với lơ bệnh lý khơng được điều trị (p = 0,014 < 0,05), cho thấy tác dụng ức chế enzym AChE rõ rệt của DNP.

- Chuột OBX điều trị bằng acid ursolic ở cả 2 mức liều 6 và 12 mg/kg/ngày cũng làm giảm đáng kể hoạt độ enzym AChE vỏ não của chuột OBX so với lơ bệnh lý khơng được điều trị (p lần lượt là 0,021; 0,022 < 0,05).

Như vậy, UA cho thấy tiềm năng ức chế enzym AChE, và cả 2 mức liều 6 và 12 mg/kg, đều hiệu quả tương tự với thuốc chứng dương DNP.

3.1.3.4. Ảnh hưởng của acid ursolic lên biểu hiện protein ChAT và VEGF hồi hải mã

Mức độ biểu hiện của protein ChAT, VEGF vùng hồi hải mã đã được xác định bằng kỹ thuật Western blot (WB) (Hình 3.17).

Hình 3.17. Ảnh hưởng của UA lên biểu hiện protein ChAT và VEGF trong hồi hải mã

chuột dùng phương pháp Western blot.

(A) Hình ảnh đại diện của phân tích dữ liệu WB; (B1) Đồ thị phân tích so sánh mức độ biểu hiện protein ChAT; (B2) Đồ thị phân tích so sánh mức độ biểu hiện protein VEGF. Mức độ biểu hiện của các protein đích được hiệu chuẩn (normalization) theo mức độ biểu hiện của β-actin trước khi đem so

sánh giữa các nhĩm chuột nghiên cứu. (*p < 0,01 khi so sánh lơ sinh lý với lơ bệnh lý, #p < 0,01, #p < 0,05 khi so sánh các lơ thuốc với lơ bệnh lý OBX, n=6).

(one-way ANOVA, hậu kiểm Student-Newman-Keul’s).

Kết quả định lượng biểu hiện protein ChAT thể hiện ở Hình 3.17B1 cho thấy: - Lơ bệnh lý OBX đã giảm rõ rệt biểu hiện protein ChAT trong hồi hải mã khi so sánh với lơ chứng sinh lý (p = 0,028 < 0,05).

- Chuột OBX được điều trị bằng DNP liều 1,5 mg/kg/ngày cĩ biểu hiện protein ChAT cao hơn rõ rệt so với chuột OBX khơng được điều trị (p = 0,004 < 0,01).

- Chuột OBX được uống acid ursolic hàng ngày với liều 6 mg/kg cĩ biểu hiện protein ChAT cao hơn đáng kể so với lơ bệnh lý khơng được điều trị (p = 0,029 < 0,05).

Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện protein VEGF được chỉ ra trong Hình 3.17B2 như sau:

- Mức độ biểu hiện protein của VEGF trong thùy hải mã chuột OBX bị giảm rõ rệt so với lơ sinh lý (p = 0,028 < 0,05).

- Chuột OBX được điều trị bằng DNP liều 1,5 mg/kg/ngày cĩ biểu hiện protein VEGF cao hơn đáng kể so với chuột OBX khơng được điều trị (p = 0,027 < 0,05), điều này tương đồng với kết quả thu được trong giai đoạn nghiên cứu trước đĩ (mục 3.1.1.6).

- Chuột OBX được điều trị bằng acid ursolic 6 mg/kg/ngày cĩ biểu hiện protein VEGF cao hơn rõ rệt so với chuột OBX khơng được điều trị (p = 0,001 < 0,01).

Như vậy, chuột OBX cĩ sự suy giảm đáng kể hoạt động của hệ cholinergic, thể hiện thơng qua tăng hoạt độ enzym AChE trong vỏ não cũng như giảm biểu hiện marker protein của enzym tổng hợp acetylcholin ChAT. Đồng thời, yếu tố VEGF của chuột OBX cũng bị suy yếu, thể hiện thơng qua giảm biểu hiện marker protein VEGF vùng hồi hải mã. Acid ursolic 6 mg/kg/ngày và DNP 1,5 mg/kg/ngày đều cho thấy tác dụng cải thiện rõ rệt cả hệ cholinergic và VEGF.