(1) Phân tích sự thay đổi kích thước não thất bên
Các tiêu bản não ở ≈ -1,46 mm tính từ vùng bregma được nhuộm bằng tím cresyl và được dùng để tính tốn kích thước của não thất bên. Vùng não thất bên được quan sát trên kính hiển vi Olympus PROVIS® (Olympus Inc., Tokyo, Nhật Bản) dưới độ phĩng đại vật thể × 1,25. Kích thước của vùng não thất bên được tính tốn bằng phần mềm Image J (phiên bản 1.41; NIH, MD, USA) [76].
Thơng số đánh giá: so sánh sự thay đổi tỷ lệ % giữa diện tích não thất bên trên tổng diện tích của lát cắt não.
(2) Nhuộm hĩa mơ miễn dịch
Các tế bào thần kinh cholinergic trong vách giữa và các tế bào thần kinh mới sinh trong vùng hồi răng hồi hải mã được phân tích tương ứng bằng cách nhuộm hĩa mơ miễn dịch với chỉ dấu cholin acetyltransferase (ChAT, vị trí bregma≈ +0.98mm) và doublecortin (DCX, bregma ≈ −1.70mm) trên tiêu bản lát cắt não chuột. Lát cắt não được loại bỏ paraffin bằng xylen và rehydrat hĩa bằng các dung dịch ethanol với các nồng độ giảm dần (100%, 95%, 75%, 50%) và cuối cùng là nước cất. Sau khi ngâm rửa trong dung dịch đệm PBS, lát cắt não được ủ trong dung dịch hoạt hĩa kháng
nguyên (Target retrieval solution, Dako, Nhật Bản) ở nhiệt độ 95oC trong 30 phút. Sau khi rửa lại với nước cất, lát cắt được ủ với dung dịch H2O2 0,1% trong 30 phút để loại bỏ peroxidase nội sinh trong tế bào, sau đĩ ủ lát cắt não với dung dịch 5% albumin huyết thanh bị (BSA) trong PBS, thời gian 1 giờ ở nhiệt độ phịng. Ủ lát cắt trong kháng thể sơ cấp đa dòng anti-ChAT (AB-144P; Millipore, CA, USA, độ pha lỗng 1:200) hoặc anti-DCX (ab18723, Abcam, Cambridge, UK, độ pha lỗng 1:200) ở nhiệt độ phịng trong 1 giờ rồi để qua đêm ở 4oC. Sau khi rửa với đệm PBS, lát cắt được ủ trong kháng thể thứ 2 tương ứng (anti-goat hoặc anti-rabbit) ở nhiệt độ phịng trong 1 giờ rồi nhuộm màu với dung dịch DAB (3,3'-diaminobenzidin), hematoxylin và loại nước để quan sát [164].
Tiêu bản não chuột được quan sát dưới kính hiển vi Olympus PROVIS® vật kính 10x và đếm số lượng tế bào dương tính (bắt màu nâu của DAB) với ChAT ở vách ngăn giữa và DCX (trên vùng cận tế bào hạt của vùng hồi răng).
Thơng số đánh giá:
- Số lượng tế bào dương tính với ChAT trong 1 lát cắt của mỗi não chuột (trung bình của 2-3 lát cắt/não) ở vị trí bregma ≈ +0.98 mm
- Số lượng tế bào dương tính với DCX trong 1 lát cắt của mỗi não chuột (trung bình của 2-3 lát cắt/não) ở vị trí bregma ≈ −1.70 mm
2.2.5.2. Phương pháp nghiên cứu hĩa thần kinh (neurochemical study)
Sau khi kết thúc thử nghiệm hành vi, dùng pentobarbital gây mê và giết chuột, tách vùng vỏ não và hồi hải mã đặt ngay vào trong nitơ lỏng để bảo quản tạm thời, sau đĩ cất trong tủ âm 80oC để bảo quản lâu dài cho đến khi tiến hành các thí nghiệm tiếp theo (Hình 2.12.)