2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.4. Các thử nghiệm hành vi
Các thử nghiệm hành vi trong nghiên cứu này được phân tích bằng phần mềm ANY MAZE (ver. 4.99, Stoelting Co., IL, Mỹ), là hệ thống theo dõi trực tiếp video ghi bằng camera kết nối với máy tính và phân tích hành vi tự động tiên tiến nhất hiện nay.
2.2.4.1. Thử nghiệm hành vi đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ
(1) Thử nghiệm nhận diện vật thể (object recognition test - ORT)
Thử nghiệm nhận diện vật thể (ORT) dựa vào đặc tính tự nhiên ưa khám phá cái mới của lồi gặm nhấm và được sử dụng để kiểm tra trí nhớ ngắn hạn, khơng liên quan đến khơng gian, được thực hiện vào ngày thứ 17 của thí nghiệm theo cơng bố của các tác giả Xoan Le và cộng sự [76], Yamada và cộng sự [75] (Hình 2.5.).
Hình 2.5. Thử nghiệm nhận diện vật thể
Hệ thống ORT gồm 1 hình hộp kích thước 35 x 35 x 50 cm và các vật thể bao gồm O1, O2 giống hệt nhau, O3 cĩ hình dạng và kích thước khác O1, O2. 24 giờ trước khi tiến hành thử nghiệm ORT, chuột được đặt vào hình hộp, cho phép tự do khám phá khơng gian mở trong 10 phút (open field). Ngày thử nghiệm gồm cĩ 2 giai đoạn: giai đoạn luyện tập và giai đoạn kiểm tra. Ở giai đoạn luyện tập, mỗi chuột được đặt vào hộp hình trụ ngày hơm trước, cĩ bổ sung thêm 2 đồ vật giống nhau O1 và O2. Chuột được phép tự do khám phá 2 đồ vật này trong 5 phút. Giai đoạn kiểm tra được tiến hành sau giai đoạn luyện tập 30 phút, trong đĩ O1 giữ nguyên, O2 được thay bằng O3. Chuột cũng được phép tự do khám phá những đồ vật này trong 5 phút giống ở giai đoạn luyện tập. Sau mỗi lần nhấc chuột ra, các đồ vật và khơng gian trong hộp được làm sạch bằng ethanol 70% để loại bỏ sự nhận biết mùi.
Thơng số đánh giá: Thời gian chuột khám phá vật thể (giây): là khoảng thời
gian chuột hướng mũi về phía vật thể trong bán kính 2cm quanh chân vật thể.
Hoạt động khám phá đồ vật của chuột sẽ được ghi lại bằng camera và thời gian khám phá từng đồ vật (giây) được phân tích bằng phần mềm ANY MAZE (ver. 4.99, Stoelting Co., IL, Mỹ).
(2) Thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến (modified Y maze test)
Thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến cũng dựa vào đặc tính tự nhiên ưa khám phá cái mới của lồi gặm nhấm và được sử dụng để kiểm tra trí nhớ ngắn hạn liên quan đến khơng gian, được tiến hành vào ngày thứ 24 sau OBX.
Hình 2.6. Thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến
(A) Thiết kế thí nghiệm; (B) Hình ảnh ghi lại bằng phần mềm ANYMAZE
Phương pháp tiến hành theo cơng bố trước đây [76] (Hình 2.6.). Thiết bị được sử dụng là một mê lộ hình chữ Y bằng gỗ, cĩ 3 cánh tay (A, B, C), mỗi cánh tay dài 40 cm, rộng 12 cm ở phía trên và rộng 3 cm ở phía đáy, chiều cao 18 cm, cĩ gắn bảng hiệu chỉ đường (kí hiệu ●, X, ▲, như Hình 2.6) phía trên mỗi cánh để chuột quan sát và định hướng. Thí nghiệm này bao gồm 2 giai đoạn, giai đoạn luyện tập và giai đoạn kiểm tra, cách nhau 30 phút. Ở mỗi giai đoạn chuột được khám phá mê lộ trong 5 phút. Ở giai đoạn luyện tập, chuột chỉ được phép khám phá 2 cánh tay của mê lộ chữ Y (A, C), cịn một cánh tay (B) sẽ bị đĩng lại. Đến giai đoạn kiểm tra, chuột được khám phá 3 cánh tay của mê lộ chữ Y. Cánh tay đĩng trước đây đã được mở trong giai đoạn kiểm tra được gọi là cánh mới (B). Sau mỗi lần thử nghiệm, sàn và tường của mê lộ được làm sạch bằng ethanol 70% để loại bỏ sự nhận biết mùi.
Thơng số đánh giá: Tỷ lệ % thời gian khám phá cánh mới = 100 x thời gian
khám phá cánh mới/tổng thời gian khám phá cả 3 cánh (%).
Hoạt động của chuột ghi lại bằng camera, thời gian và số lần chuột khám phá các cánh được phân tích bằng ANY MAZE (ver. 4.99, Stoelting Co., IL, Mỹ). Chuột được xác định là khám phá một cánh khi phần đầu đến tồn bộ cơ thể chuột ở cánh đĩ.
(3) Thử nghiệm mê lộ nước Morris (Morris water maze test – MWM)
Thử nghiệm mê lộ nước Morris dùng để kiểm tra trí nhớ dài hạn liên quan đến khơng gian thơng qua quá trình học nhớ, được thực hiện vào ngày thứ 24 đến ngày thứ 29 của thí nghiệm, theo phương pháp của Morris đã được sửa đổi [158, 159].
Hình 2.7. Thử nghiệm mê lộ nước Morris
(A) Thiết kế thí nghiệm; (B) Hình ảnh ghi lại bằng phần mềm ANYMAZE
Mê lộ là một bể nước (nước trong suốt, khơng màu) hình trụ bằng inox sơn đen, đường kính 120 cm, cao 60 cm với 4 bảng hiệu chỉ đường gắn trên thành bể cách đều nhau (kí hiệu ●, X, ▲, ■ như Hình 2.7), đặt trong buồng tối (cường độ ánh sáng 8-9
lux), nhiệt độ nước duy trì 20 ± 1°C. Một bến đỗ (platform) bằng nhựa trong suốt, bề mặt sơn đen cùng màu với nền đen của bể nước (khi bến đỗ chìm dưới mặt nước, chuột khơng nhìn thấy bến đỗ). Chuột được để ổn định trong phịng thí nghiệm ít nhất 30 phút trước khi thử nghiệm bắt đầu. Đầu chuột hướng vào thành bể, thả nhẹ tay trên mặt nước để chuột bơi và tránh sợ hãi.
Quy trình thử nghiệm gồm 3 bài tập như sau:
- Chuẩn bị luyện tập (pre-training): bài tập nhìn thấy bến đỗ (1 ngày)
Ngày 1, bến đỗ được đặt cao hơn mặt nước 1 cm. Chuột được thả ở vị trí gĩc phần tư khơng cĩ bến đỗ và bơi tự do trong vịng 1 phút để tìm bến đỗ. Nếu chuột tự tìm được bến đỗ thì cho ở đĩ 20 giây. Nếu sau 1 phút chuột khơng thấy bến đỗ thì dẫn đường để chuột tìm được bến đỗ và ở đĩ 20 giây. Nếu thời gian vượt quá 1 phút mà chuột chưa lên được bến đỗ, thời gian được ghi nhận là 1 phút.
- Luyện tập (training): bài tập khơng nhìn thấy bến đỗ (4 ngày)
Từ ngày 2 đến ngày 5, bến đỗ đặt dưới mặt nước 1 cm, chuột được luyện tập bài tập khơng nhìn thấy bến đỗ 4 lần/ngày, mỗi lần cách nhau 1 phút. Giữa các lần chuột được lau và sấy khơ lơng. Vị trí thả mỗi lần là ở 4 điểm khác nhau trong mê lộ, từ đĩ chuột được tự do bơi tìm bến đỗ dựa vào việc quan sát các bảng chỉ dẫn, trong
vịng 1 phút. Chuột sẽ được hướng dẫn để tìm bến đỗ nếu như nĩ khơng tự tìm được bến đỗ sau 1 phút. Khi lên được bến đỗ, chuột sẽ được ở đĩ 20 giây.
Thơng số đánh giá: tiềm thời (giây) (giá trị trung bình thời gian tìm thấy bến
đỗ của 4 lần tập trong ngày), quãng đường bơi (m) (giá trị trung bình quãng đường
bơi đến khi tìm thấy bến đỗ của 4 lần tập trong ngày) và tốc độ bơi (m/s) (giá trị trung bình tốc độ bơi của 4 lần tập trong ngày 5).
- Kiểm tra thăm dị (probe test): bài tập khơng cĩ bến đỗ (1 ngày)
Ngày 6, bến đỗ được bỏ ra khỏi mê lộ, trí nhớ của chuột được kiểm tra bằng bài tập khơng cĩ bến đỗ. Chuột bơi trong mê lộ 1 lần duy nhất trong 1 phút. Chuột dựa vào các bảng chỉ dẫn ở thành bể để tìm bến đỗ và cĩ xu hướng bơi lâu tại gĩc phần tư mê lộ đặt bến đỗ những ngày tập trước (cung phần tư đích).
Thơng số đánh giá: thời gian chuột bơi ở cung phần tư đích (giây).
Tất cả số liệu và hành vi trong thử nghiệm mê lộ nước Morris được phân tích bằng phần mềm ANY MAZE (ver. 4.99, Stoelting Co., IL, Mỹ).
2.2.4.2. Thử nghiệm hành vi đánh giá tác dụng chống trầm cảm
(1) Thử nghiệm treo đuơi (tail suspension test, TST)
Thử nghiệm treo đuơi được thực hiện nhằm phân tích hành vi tuyệt vọng của chuột, được thực hiện theo phương pháp của Steru và cộng sự [160]. Dụng cụ thí nghiệm là một giá treo bằng kim loại đặt trong một khơng gian kín, tách biệt với bên ngồi để tránh chuột cĩ quan sát hoặc tương tác với mơi trường xung quanh. Chuột bị treo đuơi trong khoảng thời gian 6 phút ở độ cao 40 cm so với mặt sàn, tính từ đầu chuột (Hình 2.8.).
Hình 2.8. Thử nghiệm treo đuơi
Trạng thái stress khơng thể trốn thốt do bị treo đuơi sẽ tiến triển thành tư thế bất động trên chuột thử nghiệm. Trạng thái bất động được định nghĩa là trạng thái
chuột khơng cĩ bất cứ hoạt động nào khác ngồi các cử động hơ hấp thơng thường. Các thuốc chống trầm cảm cĩ xu hướng làm giảm thời gian bất động trên chuột và làm tăng hành vi theo xu hướng trốn thốt.
Thơng số đánh giá: thời gian bất động của chuột (giây): được ghi nhận trong
5 phút sau của thử nghiệm.
Hoạt động của chuột ghi lại bằng camera, thời gian bất động của chuột được tính tốn bằng phần mềm ANY MAZE, Stoeling, Mỹ. Trạng thái bất động của chuột, bao gồm cả Immobility và Freezing, được ghi nhận trên phần mềm theo thơng số cài đặt khoảng thời gian khơng cĩ chuyển động của động vật tương ứng là 500 mili giây (minimum immobility period, cùng với immobility sensibility 90%) và 250 mili giây (minimum freeze duration).
(2) Thử nghiệm bơi cưỡng bức (forced swimming test, FST)
Thử nghiệm bơi cưỡng bức được thực hiện theo phương pháp đã được cơng bố trước đây [161, 162]. Dụng cụ là 1 bể hình trụ bằng thủy tinh trong suốt (cao 60 cm × 12 cm đường kính), được đổ nước 20 ± 1°C) cĩ độ cao từ 28-30 cm đủ để đuơi chuột khơng chạm vào đáy bình và chuột khơng thể trèo ra khỏi bình. Trạng thái stress khơng thể trốn thốt do bị đặt trong bể nước sẽ tiến triển thành tư thế bất động trên chuột thử nghiệm. Trước thử nghiệm 24h, chuột được luyện tập trong bể nước 6 phút. Giai đoạn thử nghiệm được tiến hành với việc thả chuột vào bể trong thời gian 6 phút. Sau thí nghiệm, chuột được lau và sấy khơ lơng trước khi thả về chuồng (Hình 2.9.).
Hình 2.9. Thử nghiệm bơi cưỡng bức
Trong đĩ, trạng thái bất động được định nghĩa là trạng thái chuột khơng cĩ bất cứ hoạt động nào khác ngồi các hoạt động nhằm giữ đầu/mũi ở trên mặt nước; hành vi trèo được định nghĩa là những chuyển động dọc, mạnh mẽ của chuột sử dụng 2 chân trước hướng vào thành bể nước.
Thơng số đánh giá: Thời gian bất động của chuột (giây) và thời gian trèo của chuột (giây): được tính trong 5 phút sau của thử nghiệm.
Hoạt động của chuột ghi lại bằng camera, thời gian bất động của chuột được tính tốn bằng phần mềm ANY MAZE, Stoeling, Mỹ; thời gian trèo được ghi nhận bằng đồng hồ bấm giây bởi hai quan sát viên cĩ kinh nghiệm trong điều kiện mù, lấy giá trị trung bình. Trạng thái bất động của chuột, bao gồm cả Immobility và Freezing, được ghi nhận trên phần mềm theo thơng số cài đặt khoảng thời gian khơng cĩ chuyển động của động vật tương ứng là 500 mili giây (minimum immobility period, cùng với immobility sensibility 90%) và 250 mili giây (minimum freeze duration).
(3) Thử nghiệm tiêu thụ saccharose (sucrose preference test - SPT) trên mơ hình UCMS
Thử nghiệm tiêu thụ saccharose được sử dụng để đánh giá trạng thái giống “anhedonia” (tình trạng thiếu hồn tồn niềm vui hoặc mất nhu cầu trải nghiệm và tận hưởng cuộc sống). Thử nghiệm được tiến hành mỗi tuần một lần trong suốt thời gian gây mơ hình UCMS (tổng cộng 5 lần) theo Mizuki và cộng sự [100], Daodee và cộng sự [163]. Trước khi thử nghiệm, mỗi chuột được cơ lập trong một lồng riêng lẻ và khơng được cho thức ăn, nước uống trong 18 giờ. Trong thử nghiệm, hai vịi uống được đặt tại lồng qua đĩ chuột cĩ thể uống nước máy hoặc dung dịch saccharose 2% (kl/tt) trong 1 giờ. Vị trí của 2 vịi uống được đổi chỗ ngẫu nhiên. Thể tích dung dịch saccharose 2% được tiêu thụ trong khoảng thời gian 1 giờ được ghi lại. Cân nặng chuột cũng được theo dõi 1 lần/tuần vào ngày thử nghiệm saccharose.
Thơng số đánh giá: Lượng saccharose tiêu thụ (g/kg thể trọng): được tính
trên trọng lượng cơ thể chuột theo cơng thức như sau:
Lượng saccharose (g/kg thể trọng) = (0,02 x V)/ (0,001 x m)
Trong đĩ: V: thể tích dung dịch saccharose chuột uống trong 1 giờ (ml) m: khối lượng chuột (g)
(4) Thử nghiệm mơi trường mở (open field test, OFT) trên mơ hình UCMS
của chuột từ đĩ loại trừ kết quả dương tính giả từ việc tăng vận động do thuốc gây ra. Ngồi ra, hành vi chải lơng trong mơi trường mở để đánh giá mức độ căng thẳng do UCMS gây ra. Dụng cụ là một buồng plexiglass trong suốt, sàn đen, kích thước 40 cm x 40 cm x 50 cm, được gắn với bộ phát quang và tế bào quang điện Digiscan (Omnitech Electronics, Columbus, OH) tạo thành lưới x-y gồm các chùm tia hồng ngoại vơ hình chia buồng thành 16 ơ vuơng nhỏ (Hình 2.10.). Thử nghiệm được thực hiện ở nhiệt độ phịng 25 ± 1oC, ánh sáng 9-10 lux. Chuột được thả vào buồng trong vịng 10 phút, khi di chuyển sẽ chạm lưới hồng ngoại. Máy phân tích ghi lại và phân tích thơng tin khi lưới hồng ngoại bị chạm. Phần mềm máy tính sẽ phân tích thơng số đo lường hoạt động của chuột trong thời gian thử nghiệm. Sau mỗi lần thử nghiệm, sàn và tường buồng được làm sạch bằng ethanol 70% để loại bỏ sự nhận biết mùi.
Hoạt động theo chiều ngang được định nghĩa là tổng số lần ngắt chùm tia xảy ra trong cảm biến ngang và hoạt động theo chiều dọc được xác định là tổng số lần ngắt chùm tia xảy ra theo phương thẳng đứng.
Hành vi chải lơng được định nghĩa là khi chuột dùng 2 chân trước gãi vào đầu, mặt, cổ hoặc quay hẳn đầu ra sau để liếm lơng.
Thơng số đánh giá: hoạt động theo chiều ngang (horizontal activity - units), hoạt động theo chiều dọc (vertical activity - units) và thời gian chải lơng (giây).
Hoạt động của chuột được ghi lại bằng camera; hoạt động theo chiều ngang và hoạt động theo chiều dọc được ghi nhận tự động bằng máy; thời gian chải lơng được ghi nhận bằng đồng hồ bấm giây bởi hai quan sát viên cĩ kinh nghiệm trong điều kiện mù, lấy giá trị trung bình.
Hình 2.10. Thử nghiệm mơi trường mở