3.2. Biểu hiện các cecropin tái tổ hợp
3.2.4. Kết quả xử lý cecropin dung hợp GST-cecropin và Trx-cecropin vớ
cecropin tinh sạch.
3.2.4. Kết quả xử lý cecropin dung hợp GST-cecropin và Trx-cecropin với protease protease
Với mong muốn thu được cecropin độc lập để tránh trường hợp Tag làm ảnh hưởng tới hoạt tính của cecropin, chúng tơi phải tiến hành loại bỏ Tag bằng các protease đã được thiết kế trong vector biểu hiện. Cụ thể như sau:
Xử lý GST-cecropin với protease thrombin
Các phân đoạn chứa GST-cecropin được thẩm tách loại bỏ glutathione reduced tự do trước khi xử lý với thrombin để giải phóng cecropin khỏi GST. Do lượng GST-cecropin bước đầu thu được cịn ít nên không thể xác định được nồng độ protein GST-cecropin để tính tốn lượng thrombin cần thiết. Trong số 3 GST-cecropin thì GST-cecH tinh sạch được lượng nhiều nhất nên bước đầu để kiểm tra khả năng loại bỏ Tag khỏi cecropin dung hợp, chúng tôi quyết định bổ sung 5 U thrombin vào 400 µl GH (hỗn hợp các phân đoạn E chứa GST-cecH).
Hỗn hợp này được ủ ở 220C trong 16 giờ. Nếu GST-cecH xử lý tốt với thrombin sẽ tạo ra 2 băng: 1 băng có kích thước khoảng 25 kDa là kích thước của GST và 1 băng có kích thước 7 kDa là kích thước của cecH. Để kiểm tra kết quả xử lý với thrombin, chúng tôi tiến hành điện di, kết quả được trình bày trên Hình 35.
Hình 35. Kết quả điện di xử lý GST-cecH với thrombin trên gel SDS-PAGE 10%. Giếng
GH: GST-cecH trước xử lý với thrombin; GH/T: GST-cecH sau xử lý với thrombin; GST: băng 26 kDa của GST tinh sạch.
Kết quả ở Hình 35 cho thấy băng 32 kDa của GST-cecH ở giếng sau xử lý đã khơng cịn như bên giếng trước xử lý nữa; đồng thời băng khoảng 25 kDa xuất hiện đậm hơn ở giếng sau xử lý. Điều này cho thấy GST-cecH đã được xử lý hồn tồn. Do kích thước của cecropin nhỏ (7 kDa) nên không thể quan sát được băng protein này trên gel SDS-PAGE. Kết quả này cho thấy bước đầu chúng tơi đã giải phóng được cecH khỏi GST.
Thu nhận cecropin từ Trx-cecropin bằng protease enterokinase
Do lượng Trx-cecH và Trx-cecN tinh sạch được khá sạch và với hàm lượng lớn hơn rất nhiều so với GST-cecropin nên chúng tôi tiến hành đo hàm lượng protein của 2 mẫu này bằng phương pháp Bradford để xác định lượng enterokinase sử dụng. Trong đó: TH là hỗn hợp các
phân đoạn E chứa Trx-cecH và TN là hỗn hợp các phân đoạn E chứa Trx-cecN. Kết quả thu được như sau:
Bảng 10. Nồng độ protein của Trx-cecH và Trx-cecN.
Mẫu A595 [Protein] (µg/ml)
TH 0.274 79.39
TN 0.165 43.79
Trước khi tiến hành cắt chúng tôi tiến hành thẩm tách loại bỏ imidazole dạng tự do trong đệm chứa Trx-cecH và Trx-cecN. Sau thẩm tách chúng tôi nhận thấy 2/3 Trx-cecH và Trx- cecN trở về trạng thái cặn (Hình 36A). Hiện tượng này có thể do thời gian thẩm tách chưa phù hợp hoặc đệm thẩm tách chưa hợp lý. Lượng Trx-cecH ở dạng tan cịn lại vẫn nhìn thấy trên điện di (TH2) nên chúng tôi quyết định tiến hành xử lý thử 200 µl Trx-cecH với 1 µl enterokinase 2 µg/ml ủ ở 250C trong 16 giờ. Để kiểm tra khả năng Trx-cecH tiếp tục trở về trạng thái cặn, sau xử lý chúng tôi tiến hành ly tâm. Sau ly tâm, tiếp tục quan sát thấy xuất hiện cặn. Điện di kiểm tra phần dịch và cặn sau ly tâm, kết quả được thể hiện ở Hình 36B.
Hình 36. Kết quả điện di kiểm tra khả năng trở về trạng thái cặn của Trx-cecH sau khi thẩm
tách (A) và sau khi xử lý với enterokinase (B) trên gel SDS-PAGE 12%. Giếng TH: Trx-cecH trước thẩm tách; TH1: phần cặn của TH sau thẩm tách; TH2: phần dịch của TH sau thẩm tách; TH2/E1: phần cặn của TH2 sau xử lý với enterokinase; TH2/E2: phần dịch của TH2 sau xử lý với enterokinase.
Kết quả điện di cho thấy sau xử lý với enterokinase Trx-cecH lại tiếp tục trở về dạng cặn (chiếm 2/3 lượng Trx-cecH đưa vào xử lý) trong khi đó phần dịch sau cắt vẫn quan sát thấy 1 phần Trx-cecH (vị trí mũi tên màu xanh). Băng 25 kDa vẫn quan sát thấy ở phần dịch sau xử lý enterokinase (TH2/E2) cho thấy Trx-cecH không được xử lý thành công với enterokinase bởi nếu xử lý thành cơng thì phải tạo 2 băng (băng của phần Tag với kích thước 18 kDa và băng của cecH với kích thước 7 kDa).
Hiện tượng protein bị trở về dạng cặn trong quá trình nghiên cứu thực nghiệm với protein như tinh sạch, tinh thể hóa, ... thậm chí cả trong sản xuất cơng nghiệp và sản xuất dược liệu là vấn đề phổ biến [6, 17]. Nguyên nhân của hiện tượng này chủ yếu do: nồng độ protein ở mức độ cao, do các đệm sử dụng trong thao tác không phù hợp, do thời gian bảo quản lâu, điều kiện bảo quản khơng thích hợp, ... Để khắc phục hiện tượng này, cách thức được sử dụng phổ biến là bổ sung vào đệm chứa protein một số hợp chất như: ure, các amino axit (glycine, L- arginine), đường (sucrose, glucose, lactose), các chất tẩy rửa (Tween 20, Tween 80, Nonidet P-40), ... với nồng độ thích hợp [6]. Đặc biệt, kết quả nghiên cứu của Shahravan và cs. khi tiến hành tối ưu hóa điều kiện loại bỏ His Tag khỏi protein tái tổ hợp của mình bằng enterokinase cho thấy: sự thay đổi pH của đệm, nhiệt độ và lượng enzyme xử lý khơng làm ảnh hưởng tới hoạt tính loại bỏ His Tag của enterokinase. Chỉ đến khi bổ sung thêm vào đệm xử lý ure (1-4 M) thì mới loại bỏ His Tag thành công [51]. Các nhà nghiên cứu này giải thích rằng sự có mặt của ure đã giúp protein dung hợp để lộ ra vị trí nhận biết của enterokinase nên đã giúp xử lý thành công. So sánh với kết quả xử lý Trx-cecH với enterokinase trong nghiên
cứu của mình, chúng tơi nhận thấy đây có thể là hướng giải quyết mà trong thời gian tới chúng tơi sẽ thực hiện để có thể thu cecropin độc lập từ lượng lớn Trx-cecropin đã tinh sạch được.
CHƢƠNG 4-THẢO LUẬN