3.1. Tách dòng (subclone) chuyển các gen cecropin vào các vector biểu hiện
3.1.4. Thiết kế vector biểu hiện pET-32b-cecropin
Để chuyển các gen cecH, cecN từ vector pBS-cecH, pBS-cecN và chuyển gen cecT từ
vector pCR2.1-cecT sang vector pET-32b, chúng tơi tiến hành thiết kế mồi pET32b-Nco-cec (có trình tự nhận biết của enzyme giới hạn NcoI ở đầu 5', liền kề ngay sau đó là phần trình tự của gen cecropin). Hai mồi pET 32b-Nco-cec và mồi T 7 được sử du ̣ng đ ể nhân các gen
cecropin từ vector pBS-cecH, pBS-cecN và pCR2.1-cecT. Các đoạn gen này và vector pET-
32b được xử lý với 2 enzyme NcoI và EcoRI. Sau xử lý, cả đoạn chèn và vector được tinh
sạch từ gel agarose bằng bộ kit QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN). Kết quả tinh sạch đươ ̣c trình bày trên Hình 18.
Hình 18. Điện di kết quả tinh sạch cecH, cecN (A) và cecT (B) trên gel agarose 2% và
pET-32b (C) trên gel agarose 1% sau xử lý với NcoI và EcoRI. Giếng 1-4: cecH, cecN, cecT và pET-32b không xử lý với NcoI và EcoRI; giếng 1’-4’: cecH, cecN, cecT và pET-32b xử lý với NcoI và EcoRI; M1: marker ADN 100 bp; M2: marker ADN 1 kb.
Sau tinh sạch, các gen cecropin và pET-32b được nối với nhau nhờ enzyme T4 DNA ligase. Sản phẩm được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21 (DE3) và E. coli JM109. Kết quả sàng lọc các khuẩn lạc bằng phương pháp PCR với cặp mồi vector và cặp mồi của gen
cecropin được trình bày trên Hình 19.
Hình 19. Điện di kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pET-32b-cecropin
với cặp mồi củ a vector trên gel agarose 1% (A, B, C) và với cặp mồi của gen cecropin trên
gel agarose 2% (D). Giếng --: đối chứng âm (khơng có ADN khn); 1-7: các khuẩn lạc của
cecH; 8-14: các khuẩn lạc của cecN; 15-22: các khuẩn lạc của cecT; M1: marker ADN 100
bp; M2: marker ADN 1 kb.
Với cặp mồi củ a vector (Hình 19A-C), các khuẩn lạc cho băng 800 bp chứng tỏ chỉ có vector pET-32b khơng mang đoạn chèn; các khuẩn lạc cho băng 1 kb chứng tỏ có mang vector pET-32b chứa đoạn chèn có kích thước khoảng 200 bp. Một số khuẩn lạc cho băng 1 kb được kiểm tra tiếp với cặp mồi của cecropin đều cho băng kho ảng 200 bp là kích thước
của gen cecropin (Hình 19D). Kết quả này khẳng định chúng tôi đã thiết kế thành công các
vector biểu hiện pET-32b-cecH, pET-32b-cecN và pET-32b-cecT.
Các vector tái tổ hợp biểu hiện nằm trong cả 2 chủng tế bào biểu hiện E. coli BL21 (DE3) và E. coli JM109 sẽ được sử dụng để biểu hiện và tinh sạch các cecropin tái tổ hợp là cecH,
cecN và cecT.