ứng (OD600) (mM) (giờ) (0C)
0.4 0.1 1 25
0.6 0.5 3 30
0.8 1 5 37
Qua đêm
Với mỗi cecropin nằm trong các vector biểu hiện khác nhau cũng như các hệ thống biểu hiện khác nhau đều có điều kiện biểu hiện tối ưu riêng. Cụ thể như sau:
Biểu hiện GST-cecropin
Mức độ biểu hiện của các protein dung hợp GST-cecH, GST-cecN và GST-cecT có sự khác nhau tùy thuộc vào các thông số biểu hiện nêu trong Bảng 7. Kết quả biểu hiện GST-cecH trong chủng E. coli BL21 (DE3) ở 2 thông số là nồng độ IPTG (0.5 và 1 mM) và nhiệt độ
nuôi cấy (300C và 370C) được minh họa trên Hình 20. Kết quả này cho thấy GST-cecH (kích thước 32 kDa) được biểu hiện tối ưu ở nồng độ IPTG 1 mM và nhiệt độ ni cấy 370C.
Hình 20. Kết quả điện di protein tổng số của tế bào E. coli BL21 (DE3) mang vector pGEX-
cecH trên gel SDS-PAGE 10%. Giếng --: tế bào không cảm ứng IPTG; 1: tế bào cảm ứng 1
mM IPTG; 0.5: tế bào cảm ứng 0.5 mM IPTG; 300C: tế bào nuôi cấy ở 300C; 370C: tế bào nuôi cấy ở 370
Tương tự như vậy, lượng cecropin dung hợp GST-cecN biểu hiện tăng lên đáng kể khi nhiệt độ nuôi cấy tăng từ 300C lên 370
C. Tuy nhiên, khác với GST-cecH, khi tăng nồng độ IPTG từ 0.5 mM lên 1 mM thì lượng GST-cecN biểu hiện khơng thay đổi (Hình 21). Như vậy, nhiệt độ và nồng độ IPTG tối ưu cho biểu hiện GST-cecN là 370C và 0.5 mM.
Hình 21. Kết quả điện di protein tổng số của tế bào E. coli BL21 (DE3) mang vector pGEX-
cecN trên gel SDS-PAGE 10%. Giếng --: tế bào không cảm ứng IPTG; 1: tế bào cảm ứng 1
mM IPTG; 0.5: tế bào cảm ứng 0.5 mM IPTG; 300C: tế bào nuôi cấy ở 300C; 370C: tế bào nuôi cấy ở 370C; L: protein tổng số có băng protein 33 kDa đã biết.
Hai chủng tế bào E. coli BL21 (DE3) và E. coli JM109 biểu hiện tốt GST-cecH và GST-
cecN. Tuy nhiên, cả hai chủng vi khuẩn này đều biểu hiện GST-cecT rất ít dù đã thử ở nhiều điều kiện biểu hiện khác nhau (Hình 22).
Hình 22. Kết quả điện di protein tổng số của tế bào E. coli mang vector pGEX-cecT trên gel
SDS-PAGE 10%. Giếng --J, --B: tế bào JM109, BL21 (DE3) không cảm ứng IPTG; J, B: tế bào JM109, BL21 (DE3) cảm ứng; 0.5: tế bào BL21 (DE3) cảm ứng 0.5 mM IPTG; 1: tế bào BL21 (DE3) cảm ứng 1 mM IPTG; 300C: tế bào BL21 (DE3) cảm ứng nuôi cấy ở 300C; 370C: tế bào BL21 (DE3) cảm ứng nuôi cấy ở 370C; M: Precision Plus Protein™ Unstained Standards Bio Rad.
Chúng tôi chọn chủng vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) biểu hiện GST-cecN để xác định thời
điểm cảm ứng. Kết quả được minh họa trên Hình 23.
Hình 23. Kết quả điện di protein tổng số của tế bào E. coli BL21 (DE3) mang vector pGEX-
cecN trên gel SDS-PAGE 10%. Giếng --: tế bào không cảm ứng IPTG; 0.8: tế bào cảm ứng ở
thời điểm OD600 = 0.8; 0.4: tế bào cảm ứng ở thời điểm OD600 = 0.4; L: protein tổng số có băng protein 33 kDa đã biết.
Khi thời điểm cảm ứng với OD600 tăng từ 0.4 lên 0.8 thì lượng GST-cecN thu được giảm đi một nửa. Như vậy, thời điểm cảm ứng tối ưu cho biểu hiện GST-cecN là OD600 = 0.4.
Sau khi chuẩn các thông số biểu hiện GST-cecH, GST-cecN và GST-cecT, chúng tôi đã xác định được điều kiện tối ưu cho biểu hiện các protein dung hợp này trong cả 2 chủng tế bào biểu hiện E. coli BL21 (DE3) và E. coli JM109 (Bảng 8).
Loại GST- cecropin Thời điểm cảm ứng (OD600) Nồng độ IPTG (mM) Thời gian cảm ứng (giờ) Nhiệt độ nuôi cấy (0 C) GST-cecH 0.4 1 3 37 GST-cecN 0.4 0.5 3 37 GST-cecT 0.4 1 3 37
Với điều kiện tối ưu như trên, băng biểu hiện các GST-cecropin ở cả 2 chủng tế bào biểu hiện được trình bày trong Hình 24.
Hình 24. Kết quả điện di protein tổng số của tế bào E. coli BL21 (DE3) (A) và E. coli
JM109 (B) mang vector pGEX-cecropin ở điều kiện biểu hiện tối ưu trên gel SDS-PAGE 10%. Giếng --H, --N, --T: tế bào mang vector pGEX-cecH, pGEX-cecN, pGEX-cecT không cảm ứng IPTG; H, N, T: tế bào mang vector pGEX-cecH, pGEX-cecN, pGEX-cecT cảm ứng IPTG.
Biểu hiện cecropin dung hợp hai Tag: His+GST-cecropin
Tiến hành chuẩn các thông số biểu hiện tương tự như phần GST-cecropin, chúng tơi nhận thấy khơng có His+GST-cecropin nào được biểu hiện trong chủng tế bào E. coli JM109.
Trong khi đó, chỉ có His+GST-cecH và His+GST-cecN (kích thước 33 kDa) có biểu hiện trong chủng tế bào E. coli BL21 (DE3), cịn His+GST-cecT khơng biểu hiện được. Ở điều
kiện biểu hiện là: thời điểm cảm ứng ở OD600 là 0.4, nồng độ chất cảm ứng IPTG là 1 mM, với thời gian cảm ứng là 3 giờ và nuôi cấy ở 370C băng biểu hiện của His+GST-cecH và His+GST-cecN được thể hiện trong Hình 25.
Hình 25. Kết quả điện di protein tổng số của tế bào E. coli BL21 (DE3) mang vector pET-
28a-cecH (A) và pET-28a-cecN (B) ở điều kiện biểu hiện tối ưu trên gel SDS-PAGE 10%. Giếng --H, --N: tế bào mang vector pET-28a-cecH, pET-28a-cecN không cảm ứng IPTG; H, N: tế bào mang vector pET-28a-cecH, pET-28a-cecN cảm ứng IPTG; L: protein tổng số có băng protein 33 kDa đã biết.
Biểu hiện Trx+cecropin
Khi tiến hành chuẩn điều kiện biểu hiện Trx-cecH và Trx-cecN trong chủng E. coli BL21
(DE3), chúng tôi nhận thấy ở 2 nồng độ IPTG 0.5 mM và 1 mM đều thu được băng biểu hiện có kích thước khoảng 25 kDa. Đây là kích thước của băng protein dung hợp giữa Trx và cecropin. Tuy nhiên, lượng Trx-cecH và Trx-cecN được biểu hiện ở 2 nồng độ này khác nhau không đáng kể. Trong khi đó, nếu giảm nhiệt độ nuôi cấy từ 370C xuống 300C thì lượng protein dung hợp thu được giảm đáng kể (Hình 26).
Hình 26. Kết quả điện di protein tổng số của tế bào E. coli BL21 (DE3) mang vector pET-
32b-cecH và pET-32b-cecN trên gel SDS-PAGE 12%. Giếng --H, --H30, --H37: tế bào mang vector pET-32b-cecH không cảm ứng IPTG; --N, --N30, --N37: tế bào mang vector pET-32b-
cecN không cảm ứng IPTG; H1, H0.5, H30, H37: tế bào mang vector pET-32b-cecH cảm ứng
ở nồng độ IPTG 1 mM, nồng độ IPTG 0.5 mM, nuôi cấy ở 300C, nuôi cấy ở 370
C; N1, N0.5, N30, N37: tế bào mang vector pET-32b-cecN cảm ứng ở nồng độ IPTG 1 mM, nồng độ IPTG 0.5 mM, nuôi cấy ở 300C, nuôi cấy ở 370
C; M: Prestained Protein Molecular Weight Marker Fermentas.
Tương tự như Trx-cecH và Trx-cecN, Trx-cecT cũng được chuẩn điều kiện biểu hiện trong chủng E. coli BL21 (DE3); tuy nhiên, lượng protein dung hợp thu được ít hơn hẳn 2 loại
Hình 27. Kết quả điện di protein tổng số của tế bào E. coli BL21 (DE3) mang vector pET-
32b-cecT trên gel SDS-PAGE 12%. Giếng --3, --5, --7, --24: tế bào không cảm ứng IPTG ở thời điểm thu mẫu 3, 5, 7, 24 giờ; 3, 5, 7, 24: tế bào cảm ứng IPTG ở thời điểm thu mẫu 3, 5, 7, 24 giờ; L: protein tổng số có băng protein 25 kDa đã biết.
Sau khi chuẩn các thông số biểu hiện như trên, chúng tôi quyết định lựa chọn điều kiện biểu hiện tối ưu cho từng Trx-cecropin trong chủng E. coli BL21 (DE3) như Bảng 9.
Bảng 9. Điều kiện tối ưu biểu hiện Trx-cecropin trong chủng E. coli BL21 (DE3). Loại GST-cecropin Thời điểm cảm ứng (OD600) Nồng độ IPTG (mM) Thời gian cảm ứng (giờ) Nhiệt độ nuôi cấy (0 C) Trx-cecH 0.4 0.5 3 37 Trx-cecN 0.4 0.5 3 37 Trx-cecT 0.4 1 5 37
Khác với chủng E. coli BL21 (DE3), chủng E. coli JM109 không biểu hiện được bất kỳ loại Trx-cecropin nào ở các điều kiện biểu hiện khác nhau (Hình 28). Điều này cho thấy không thể sử dụng chủng này để thu protein dung hợp Trx-cecropin.
Hình 28. Kết quả điện di protein tổng số của tế bào E. coli JM109 mang vector pET-32b-
cecH và pET-32b-cecN trên gel SDS-PAGE 12%. Giếng --H, -N: tế bào mang vector pET- 32b-cecH, pET-32b-cecN không cảm ứng; H3, H5: tế bào mang vector pET-32b-cecH cảm ứng IPTG ở thời điểm thu mẫu 3, 5 giờ; N3, N5: tế bào mang vector pET-32b-cecN cảm ứng IPTG ở thời điểm thu mẫu 3, 5 giờ; L: protein tổng số có băng protein 25 kDa đã biết.
3.2.2. Xử lý cặn tế bào và thu nhận cecropin dung hợp dạng tan
Sử dụng điều kiện biểu hiện tối ưu đã chuẩn được cho GST-cecropin trong cả hai chủng E.
coli BL21 (DE3) và E. coli JM109; His+GST-cecH, His+GST-cecN và Trx-cecropin trong
chủng E. coli BL21 (DE3), chúng tôi tiến hành biểu hiện lượng lớn để thu lấy cặn tế bào. Cặn này sẽ được xử lý để giải phóng protein của tế bào trong đó có cecropin dung hợp. Thơng thường có 2 cách xử lý để thu dịch protein tổng số là: xử lý khơng biến tính (với các loại protein đích ở dạng tan) và xử lý biến tính (sử dụng các chất biến tính như SDS, ure, sarcozyl, ... để làm tan protein đích dạng thể vùi). Với mong muốn thu cecropin tinh sạch sau khi loại bỏ Tag không bị ảnh hưởng bởi quá trình xử lý biến tính nên chúng tơi thử ở điều kiện khơng biến tính trước với tất cả các loại cecropin dung hợp đã có. Nếu cecropin dung hợp ở dạng thể vùi thì sẽ được xử lý biến tính với SDS và ure ở các nồng độ khác nhau. Kết quả xử lý khơng biến tính protein dung hợp của cecH được trình bày trên Hình 29.
Hình 29. Kết quả điện di protein tổng số sau xử lý khơng biến tính các protein dung hợp của
cecH: GST-cecH (A), His+GST-cecH (B) trên gel SDS-PAGE 10% và Trx-cecH (C) trên gel SDS-PAGE 12%. Giếng CƯ: cặn tế bào biểu hiện, S: phần dịch sau xử lý; P: phần cặn sau xử lý.
Kết quả thu được cho thấy sau khi xử lý không biến tính, GST-cecropin và His+GST- cecropin hầu hết nằm ở dạng thể vùi (Hình 29A và 29B); trong khi đó, Trx-cecropin có một nửa nằm ở dạng tan (Hình 29C). Chính vì vậy, GST-cecropin và His+GST-cecropin sẽ tiếp tục được chuẩn điều kiện xử lý biến tính để thu được protein dung hợp ở dạng tan.
Chúng tơi lựa chọn 2 hóa chất làm tan protein dạng thể vùi hay được sử dụng là SDS và ure [36, 40]. Khi thay đổi nồng độ SDS từ 0.1% đến 0.5%, chúng tôi nhận thấy SDS 0.5% làm tan được 3/4 lượng protein GST-cecH (Hình 30A). Tương tự như vậy, chúng tôi tiến hành thử với ure trong dải nồng độ từ 1 M đến 8 M. Kết quả cho thấy chỉ đến khi ure ở nồng độ 8 M thì mới thu được 1 nửa protein GST-cecH ở dạng tan (Hình 30B), nhưng His+GST-cecH thì vẫn tồn tại ở dạng khơng tan (Hình 30C). Trong khi ure 8 M là nồng độ cao nhất được sử dụng để làm tan protein. Vì vậy, chúng tơi tạm thời chưa nghiên cứu tiếp với His+GST-cecH và His+GST-cecN nữa.
Hình 30. Kết quả điện di protein tổng số sau xử lý biến tính các protein dung hợp của GST-
cecH với SDS (A), GST-cecH với ure (B), His+GST-cecH với ure (C) biểu hiện trong chủng
E. coli BL21 (DE3) trên gel SDS-PAGE 10%. Giếng S0.5: phần dịch sau xử lý với SDS
0.5%; P0.5: phần cặn sau xử lý với SDS 0.5%; SU1, SU3, SU5, SU6, SU7, SU8: phần dịch sau xử lý với ure ở nồng độ 1, 3, 5, 6, 7, 8 M; PU1, PU3, PU5, PU6, PU7, PU8: phần cặn sau xử lý với ure ở nồng độ 1, 3, 5, 6, 7, 8 M; M: Precision Plus Protein™ Unstained Standards Bio Rad.
Các phần dịch protein tổng số sau xử lý có chứa protein dung hợp cecropin được dùng để tiến hành tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực tương ứng. Phần dịch chứa Trx-cecropin thu được từ xử lý khơng biến tính được sử dụng trực tiếp để tinh sạch theo kiểu khơng biến tính. Trong khi đó các phần dịch chứa GST-cecropin sau xử lý biến tính được tinh sạch theo hai phương pháp khác nhau là tinh sạch khơng biến tính (thẩm tách loại bỏ SDS, ure rồi tinh sạch) và tinh sạch biến tính (giữ nguyên SDS, ure để tinh sạch) nhằm so sánh hiệu suất tinh sạch của 2 phương pháp này.
3.2.3. Kết quả tinh sạch GST-cecropin, Trx-cecropin
Protein dung hợp GST-cecropin và Trx-cecropin được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực sử dụng cột gel Glutathione Sepharose 4B của hãng GE Heathcare và Ni-NTA agarose
của hãng QIAGEN. Để kiểm tra sự có mặt của protein trong các phân đoạn tinh sạch, các phân đoạn này sẽ được điện di trên SDS-PAGE 10% hoặc SDS-PAGE 12%.
Tinh sạch GST-cecropin
Khi sử dụng trực tiếp dịch sau xử lý biến tính với SDS 0.5% và ure 8 M cho tinh sạch theo phương pháp biến tính, chúng tơi nhận thấy hầu hết GST-cecropin nằm ở phân đoạn qua cột (F), số còn lại nằm trong các phân đoạn rửa (W). Điều này có nghĩa là hầu như khơng có GST-cecropin được giữ lại trên cột. Chính vì vậy, ở các phân đoạn đẩy không thu được băng 32 kDa của GST-cecropin nữa (Hình 31).
Hình 31. Kết quả điện di các phân đoạn tinh sạch protein dung hợp GST-cecH biểu hiện
trong chủng E. coli BL21 (DE3) sau xử lý biến tính với SDS 0.5% (A) và sau xử lý ure 8 M (B) theo phương pháp tinh sạch biến tính trên gel SDS-PAGE 10%. Giếng LC: dịch protein tổng số lên cột; F: dịch protein sau khi qua cột; W1, W2, W3: các phân đoạn rửa cột 1, 2, 3; E1 đến E5: các phân đoạn đẩy cột từ 1 đến 5.
Với dịch GST-cecropin sau xử lý biến tính được loại bỏ chất biến tính bằng thẩm tách chúng tơi thấy có sự khác biệt giữa 2 loại chất biến tính được sử dụng. Sau thẩm tách loại SDS, dịch protein không bị trở lại dạng cặn nhưng kết quả tinh sạch lại không thu được băng mong muốn ở các phân đoạn đẩy. Trong khi đó, sau khi loại bỏ ure thì một phần GST-
cecropin bị trở lại dạng không tan nhưng ở các phân đoạn đẩy có thu được băng 32 kDa cần tinh sạch (Hình 32).
Hình 32. Kết quả điện di các phân đoạn tinh sạch protein dung hợp GST-cecH biểu hiện
trong chủng E. coli BL21 (DE3) (A), chủng E. coli JM109 (B) sau xử lý biến tính với ure 8 M theo phương pháp tinh sạch không biến tính trên gel SDS-PAGE 10%. Giếng LC: dịch protein lên cột; F: dịch protein sau khi qua cột; W1, W3: các phân đoạn rửa cột 1, 3; E1 đến E6: các phân đoạn đẩy cột từ 1 đến 6.
Như vậy, bước đầu chúng tôi đã tinh sạch được GST-cecropin bằng cột sắc ký ái lực. Tuy rằng, ngồi băng protein mong muốn cịn có 2 băng khác phía dưới trong các phân đoạn đẩy.
Tinh sạch Trx-cecropin
Do Trx-cecropin được biểu hiện trong chủng E. coli BL21 (DE3) ở trạng thái tan nên được sử dụng trực tiếp cho tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực Ni-NTA agarose. Kết quả điện di các phân đoạn tinh sạch Trx-cecH và Trx-cecN được thể hiện trên Hình 33.
Hình 33. Kết quả điện di các phân đoạn tinh sạch protein dung hợp Trx-cecH (A) và
Trx-cecN (B) biểu hiện trong chủng E. coli BL21 (DE3) trên gel SDS-PAGE 12%. Giếng LC: dịch protein tổng số lên cột; F: dịch protein sau khi qua cột; W3: phân đoạn rửa cột 3; E1 đến E6: các phân đoạn đẩy cột từ 1 đến 6.
Băng 25 kDa khá đậm xuất hiện ở cả 6 phân đoạn đẩy (E1 đến E6) và đặc biệt là ở các phân đoạn sau các băng phụ xuất hiện mờ. Điều này cho thấy Trx-cecH và Trx-cecN được tinh sạch khá tốt. Tuy nhiên, Trx-cecT biểu hiện trong chủng E. coli BL21 (DE3) được ít hơn hẳn so với 2 cecropin này nên lượng protein dung hợp thu được cũng ít hơn và xuất hiện nhiều băng phụ hơn (Hình 34).
lên cột; F: dịch protein sau khi qua cột; W1, W3: các phân đoạn rửa cột 1, 3; E1 đến E5: các