3.1. Tách dòng (subclone) chuyển các gen cecropin vào các vector biểu hiện
3.1.2. Thiết kế vector biểu hiện pGEX-cecropin
Mồi pGEX-Bam-cec được thiết kế có trình tự nhận biết của enzyme giới hạn BamHI ở đầu
5', liền kề ngay sau đó là phần trình tự của gen cecropin. Phản ứng PCR s ử dụng pBS-cecH, pBS-cecN và pCR2.1-cecT làm khuôn với m ồi pGEX-Bam-cec và mồi T7 cho các gen
cecropin dùng để chuyển sang vector pGEX-4T-1. Kết quả PCR nhân 3 gen cecropin được trình bày trên Hình 15.
Hình 15. Điện di kết quả PCR nhân gen cecH, cecN từ pBS-cecH, pBS-cecN (A); cecT từ
pCR2.1-cecT (B) trên gel agarose 2%. Giếng --: đối chứng âm (khơng có ADN khn); M: marker ADN 100 bp.
Cả 3 gen cecropin thu được đều có kích thước như tính tốn khoảng 300 bp. Ba gen
và cecT được nối với vector pGEX-4T-1; tiếp tục biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21
(DE3) và E. coli JM109. Để thu được khuẩn lạc mang vector pGEX -4T-1 có chèn gen
cecropin, chúng tôi tiến hành sàng lọc bằng cặp mồi pGEX F/R của vector (Hình 16A) và că ̣p mời đă ̣c hiê ̣u của gen cecropin (Hình 16B).
Hình 16. Điện di kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pGEX-cecropin với cặp
mồi củ a vector (A) và của gen cecropin (B) trên gel agarose 2%. Giếng --: đối chứng âm
(khơng có ADN khn); 1-5: các khuẩn lạc của cecH; 6-10: các khuẩn lạc của cecN; 11-15:
các khuẩn lạc của cecT; M: marker ADN 100 bp.
Kết quả điện di ở Hình 16 cho thấy hầu hết các khuẩn lạc đều có băng khoảng 370 bp với cặp mồi của vector và 200 bp của gen cecropin. Kết quả này cho thấy cả 3 gen cecropin đều
được chuyển thành công vào vector pGEX-4T-1. Như vậy, chúng tôi đã thiết kế thành công các vector biểu hiện pGEX-cecH, pGEX-cecN và pGEX-cecT.