3.1. Tách dòng (subclone) chuyển các gen cecropin vào các vector biểu hiện
3.1.3. Thiết kế vector biểu hiện pET-28a-cecropin
Tương tự như thiết kế vector biểu hiện pGEX-cecropin, mồi pET28a-Eco-cec (có trình tự nhận biết của enzyme giới hạn EcoRI ở đầu 5', liền kề ngay sau đó là 1 phần trình tự của gen
GST) được thiết kế để cùng với mồi pGEX R nhân đoạn gen GST-cecropin từ vector tái tổ
hợp pGEX-cecropin. Sản phẩm PCR này và vector pET-28a được xử lý với enzyme EcoRI
và NotI rồi nối với nhau thành vector pET-28a-cecropin. Vector tái tổ hợp tạo ra được biến
nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21 (DE3) và E. coli JM109.
Trong số các khuẩn lạc thu được, chúng tôi tiến hành sàng lọc 2 khuẩn lạc của mỗi loại
cecH, cecN và cecT với cặp mồi vector và cặp mồi đặc hiê ̣u của gen GST-cecropin. Kết quả
đươ ̣c trình bày trên Hình 17.
Hình 17. Điện di kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pET-28a-cecropin trên
gel agarose 1%. Giếng 1 và 2, 3 và 4, 5 và 6: sản phẩm PCR các khuẩn lạc của cecH, cecN, cecT với cặp mồi vector; giếng 1’ và 2’, 3’ và 4’, 5’ và 6’: sản phẩm PCR các khuẩn lạc với
cặp mồi của gen GST-cecropin. Giếng --: đối chứng âm (khơng có ADN khn); M: marker
Cả 6 khuẩn lạc kiểm tra với cặp mồi vector đều cho băng có kích thước khoảng 1.3 kb. Điều này cho thấy chúng đều mang vector pET-28a có chèn thêm đoạn ADN có kích thước khoảng 900 bp (kích thướ c của đoa ̣n mã cho GST và cecropin). Với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen
GST-cecropin cả 6 khuẩn lạc cũng đều lên băng 900 bp đúng như tính tốn. Kết quả này đã
khẳng định các khuẩn lạc này đều mang vector tái tổ hợp pET-28a-cecropin. Như vậy, chúng tôi đã thiết kế thành công các vector biểu hiện pET-28a-cecH, pET-28a-cecN và pET-28a-
cecT.