1.3. Sản xuất cecropin theo con đường tái tổ hợp
1.3.2. Lựa chọn hệ thống vector biểu hiện
Để biểu hiện được lượng lớn protein tái tổ hợp, việc thiết kế vector biểu hiện phụ thuộc rất nhiều vào đặc điểm của hệ thống biểu hiện, bản chất của protein nghiên cứu cũng như mục đích sử dụng protein cho các nghiên cứu tiếp theo. Lựa chọn được vector biểu hiện phù hợp là điều kiện quyết định số lượng cũng như trạng thái protein cần tạo ra; hai yếu tố này có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất tinh sạch.
Hiện nay, do nhu cầu sản xuất AMPs tái tổ hợp ngày càng tăng nên nhiều hệ thống vector biểu hiện đã được nghiên cứu và phát triển. Tuy nhiên, khi lựa chọn đối tượng nghiên cứu là AMPs nói chung và cecropin nói riêng thì các nhà nghiên cứu phải chấp nhận nhiều thách thức hơn các protein thơng thường khác. Đó là do cecropin là peptide kháng khuẩn nên rất độc đối với hệ thống biểu hiện là vi khuẩn [7, 69]. Không những thế, khi sự biểu hiện peptide
độc ảnh hưởng tới vi khuẩn thì xu hướng peptide tạo ra thường bị đóng gói ở dạng thể vùi. Việc tinh sạch protein dạng thể vùi đòi hỏi nhiều khâu xử lý và ảnh hưởng rất nhiều tới hiệu suất tinh sạch để thu được protein có hoạt tính. Mặt khác, AMPs có kích thước nhỏ (như cecropin thường nhỏ hơn 10 kDa) nên rất khó biểu hiện hoặc dễ dàng bị các protease của tế bào phân hủy [36]. Giải pháp đưa ra là phải lựa chọn vector biểu hiện sao cho cecropin được biểu hiện dưới dạng dung hợp với 1 protein đã biết (các protein này thường được gọi là đuôi dung hợp hay Tag). Khi được biểu hiện dưới dạng dung hợp với Tag, AMPs có xu hướng ít độc với tế bào nên biểu hiện nhiều và tan dễ hơn [3, 33, 36]. Khơng những thế, do kích thước của các Tag thường lớn nên làm cho kích thước của protein dung hợp cũng tăng lên; vì vậy protein đích ít bị ảnh hưởng của protease. Mặt khác, các Tag này thường là các protein có ái lực nhất định với 1 cơ chất hay phân tử nào đó, do đó q trình tinh sạch protein dung hợp trở nên dễ dàng và có hiệu quả nhờ phương pháp sắc ký ái lực. Với nhiều ưu điểm như trên nên hiện nay các vector biểu hiện thường có một hay nhiều Tag để phù hợp với các loại protein khác nhau. Tuy nhiên, các protein khác nhau khi dung hợp với các Tag khác nhau lại cho các kết quả rất khác nhau. Biểu đồ ở Hình 8 cho thấy rõ sự khác biệt về hiệu quả biểu hiện khi sử dụng các Tag khác nhau với AMPs ở E. coli [33]. Trong đó, 3 loại Tag: GST, His và Trx có
Hình 8. Biểu đồ biểu diễn tỉ lệ (%) các đuôi protein dung hợp (Tag) được sử dụng để biểu
hiện AMPs ở E. coli [33].
Hiện nay, các vector biểu hiện hay được sử dụng có mang ba loại Tag này là pGEX-4T-1 (có GST Tag), pET-28a (có His Tag) và pET-32b (có Trx Tag). Ngồi những đặc điểm cần thiết của một vector biểu hiện như có promoter mạnh, operator, mã khởi đầu, mã kết thúc, vùng đa điểm, gen kháng kháng sinh, … thì cả ba vector biểu hiện này cịn mang nhiều đặc điểm có lợi cho q trình biểu hiện và tinh sạch CAMPs. Những đặc điểm này được trình bày trong Bảng 4. Trong số 3 Tag này, His Tag có khối lượng phân tử nhỏ (< 1 kDa) nên CAMPs có khối lượng nhỏ như cecropin (4-7 kDa) dù đã được dung hợp với His Tag thì khối lượng protein dung hợp vẫn chưa được 8 kDa. Với khối lượng thấp như vậy thì dễ bị phân hủy bởi protease của vật chủ, khó biểu hiện hoặc biểu hiện ở dạng thể vùi và rất khó phát hiện băng biểu hiện trên điện di SDS-PAGE thơng thường [16, 29, 32]. Vì vậy, để thuận tiện cho quá trình biểu hiện có thể thiết kế 2 Tag liên tiếp nhau [44, 56].
Bảng 4. Đặc điểm của các hệ thống vector biểu hiện. Tên Tên vector Loại Tag Kích thƣớc Tag Loại sắc ký ái lực dùng để tinh sạch Enzyme giải phóng cecropin khỏi Tag pGEX-4T- 1 GST 26 kDa Glutathione sepharose 4B Thrombin pET-28a His 0.66 kDa Ni-NTA agarose Enterokinase pET-32b Trx 12 kDa Ni-NTA agarose Enterokinase